一种基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于细胞水平筛选通过5‑羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法。利用RIN14B细胞作为筛选模型，通过益生菌与细胞共孵育，检测细胞上清中5‑羟色氨酸的分泌量和细胞中的色氨酸羟化酶1的mRNA水平，以确定能够通过5‑羟色氨酸发挥抗抑郁功效的益生菌。本发明专利技术筛选的有效菌株能够缓解抑郁小鼠的抑郁样行为、提高脑中神经递质和神经营养因子的水平、减轻压力导致的下丘脑‑垂体‑肾上腺轴功能亢进，且细胞模型筛选结果与动物实验结果具有显著的相关性。利用本发明专利技术能够在短时间批量测定不同菌株的抗抑郁潜力，为抗抑郁功能益生菌的筛选提供了一种更为快速、高效的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法
本专利技术涉及益生菌筛选
，具体涉及一种基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法。
技术介绍
抑郁症又称抑郁障碍，以显著而持久的情绪低落为主要临床特征。目前全球有超过3.5亿人患有抑郁症，预计到2030年，抑郁症将在全球疾病负担中居第1位。大量研究表明，抑郁症的发生与脑中单胺类神经递质失调有关，主要表现为大脑神经突触间隙的5-羟色胺(5-HT)浓度降低。目前针对抑郁的治疗方式主要集中在提高脑中5-HT的水平，例如临床一线的抗抑郁药物——选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)。此外，服用5-HT的前体——5羟色氨酸(5-HTP)也具有一定的抗抑郁效果，但因其在人体内半衰期较短，不能用作临床药物。目前针对抑郁的治疗方式主要集中在提高脑中5-HT的水平上。“脑肠轴”是近年来提出的一个新概念，作为肠内细菌与大脑间的双向通信系统，主要通过神经途径、内分泌途径和免疫途径来调节大脑的功能以及行为。研究表明，抑郁患者的肠道菌群会发生改变，而在动物实验中发现，无菌小鼠的抑郁症状能够减轻，这证明肠道菌群和抑郁的发生、发展存在联系。通过益生菌调节肠道菌群，可成为缓解抑郁症的一种新途径。目前报道的对抑郁具有缓解作用的益生菌，均通过动物实验证明。然而采用动物作为抗抑郁益生菌的筛选模型，耗时长、成本高，且无法解释其发挥作用的具体机制。细胞模型具有耗时短、成本低、通量高等优点，但目前尚未有抗抑郁益生菌的细胞筛选模型。因此，开发一种基于细胞水平测定来筛选抗抑郁功能益生菌的方法，具有十分重要的科学和实践意义。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法，其包括，细胞培养：所述细胞能够表达色氨酸羟化酶1并分泌5-羟色氨酸；所述细胞用牛血清白蛋白和氟西汀处理后与益生菌共孵育，筛选具有抗抑郁功能的益生菌。作为本专利技术所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法的一种优选方案：所述细胞包括大鼠胰岛瘤细胞RIN14B。作为本专利技术所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法的一种优选方案：所述细胞培养，其中，细胞培养基包括RPMI1640培养基。作为本专利技术所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法的一种优选方案：所述益生菌，包括双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属、丙酸杆菌属、片球菌属、芽孢杆菌属。作为本专利技术所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法的一种优选方案：所述筛选具有通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌，包括，将传代细胞以105～106/mL接种于24孔板，用含有0.1％牛血清白蛋白和1-4μmol/L氟西汀的Hank's平衡盐溶液清洗细胞，后加入含有不同益生菌的HBSS悬液，益生菌的浓度调整到107-109cfu/mL，37℃孵育20min后，收集悬液，5000～6000g离心5～10min去除沉淀，取上清液待测。作为本专利技术所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法的一种优选方案：所述筛选具有通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌，包括，与益生菌共同孵育后的所述细胞分泌的5-羟色氨酸和细胞中色氨酸羟化酶1的mRNA水平的检测。作为本专利技术所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法的一种优选方案：将所述细胞5-羟色氨酸的分泌量提高10倍以上的益生菌菌株作为筛选的有效菌株。作为本专利技术所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法的一种优选方案：所述5-羟色氨酸的分泌量采用荧光高效液相色谱进行检测分析。作为本专利技术所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法的一种优选方案：将色氨酸羟化酶1的mRNA提高50％以上的益生菌菌株作为有效菌株。作为本专利技术所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法的一种优选方案：所述色氨酸羟化酶1的mRNA水平用qPCR进行检测。本专利技术有益效果：本专利技术采用RIN14B细胞作为筛选模型，在经过氟西汀处理之后，加入益生菌共孵育后，取细胞上清检测5-HTP的含量，并裂解细胞检测其色氨酸羟化酶1(Tryptophanhydroxylase1，TPH1)mRNA的表达量，以确定益生菌能否促进肠道细胞产生神经递质前体5-羟色氨酸(5-hydroxytryptophan，5-HTP)，进而发挥抗抑郁功效。本专利技术采用实验证明：益生菌能够通过定植肠道，刺激肠道嗜铬细胞持续而缓慢的分泌5-HTP，进而为脑中5-HT的合成提供前体物质，实现抗抑郁效果。具体来说，本专利技术利用“模拟肠嗜铬细胞”(即RIN14B细胞)，通过益生菌刺激，检测其5-HTP的分泌量和TPH1mRNA的表达量，以此筛选具有抗抑郁功能的益生菌，并在动物试验中验证了筛选模型的有效性。本专利技术提供了一种基于5-HTP途径快速、高效地筛选抗抑郁功能益生菌株的方法。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为5-HTP的色谱保留时间和标准曲线示意图。(A)5-HTP和5-HT的色谱保留时间；(B)5-HTP标准曲线。图2为益生菌刺激RIN14B细胞分泌5-HTP的含量示意图；其中*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001(vs对照组)。图3为益生菌刺激后，RIN14B细胞中TPH1mRNA水平示意图；其中*P<0.05，****P<0.0001(vs对照组)。图4为益生菌干预抑郁小鼠六周后，各组小鼠的行为学变化示意图。(A)强迫游泳实验；(B)糖水偏好实验；(C)跳台实验；其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001(vs模型组)。图5为益生菌干预抑郁小鼠六周后，各组小鼠的海马组织中5-HT(A)和5-HTP(B)的水平变化示意图；其中*P<0.05，**P<0.01(vs模型组)。图6为益生菌干预抑郁小鼠六周后，各组小鼠前额叶皮质中BDNF的水平变化示意图；其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(vs模型组)。图7为本菌株干预抑郁小鼠六周后，小鼠血清中ACTH和皮质酮水平变化示意图；其中*P<0.05(v本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于细胞水平筛选通过5‑羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法，其特征在于：包括，细胞培养：所述细胞能够表达色氨酸羟化酶1并分泌5‑羟色氨酸；所述细胞用牛血清白蛋白和氟西汀处理后与益生菌共孵育，筛选具有抗抑郁功能的益生菌。

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法，其特征在于：包括，细胞培养：所述细胞能够表达色氨酸羟化酶1并分泌5-羟色氨酸；所述细胞用牛血清白蛋白和氟西汀处理后与益生菌共孵育，筛选具有抗抑郁功能的益生菌。2.根据权利要求1所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法，其特征在于：所述细胞包括大鼠胰岛瘤细胞RIN14B。3.根据权利要求1或2所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法，其特征在于：所述细胞培养，其中，细胞培养基包括RPMI1640培养基。4.根据权利要求1或2所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法，其特征在于：所述益生菌，包括双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属、丙酸杆菌属、片球菌属、芽孢杆菌属。5.根据权利要求1或2所述的基于细胞水平筛选通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌的方法，其特征在于：所述筛选具有通过5-羟色氨酸相关途径实现抗抑郁功能的益生菌，包括，将传代细胞以105～106/mL接种于24孔板，用含有0.1％牛血清白蛋白和1-4μmol/L氟西汀的Hank's平衡盐溶液清洗细胞，后加入含有不同益生菌的H...

【专利技术属性】
技术研发人员：王刚，陈卫，田培郡，赵建新，张灏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32