抗C-反应蛋白单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用制造技术

本发明专利技术涉及杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体，所述抗体能与C‑反应蛋白特异性结合。本发明专利技术还涉及包括所述杂交瘤细胞株或单克隆抗体的试剂盒。本发明专利技术的单克隆抗体在抗体纯度、可重复性、抗体效价和稳定性方面均展现出很好的性能。

【技术实现步骤摘要】
抗C-反应蛋白单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
本专利技术涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗C-反应蛋白的单克隆抗体。
技术介绍
C-反应蛋白(CRP)是相对分子质量为115～140KD的血清β球蛋白，因最早发现其和肺炎球菌的C多糖相结合而得名(1930年)，是由5个相同的亚单位以非共价键结合而成的环状五球体，由肝细胞合成，在人的血清、脑脊液、胸腹水等多种体液中均可测出。其他动物类的CRP与人CRP的氨基酸序列有惊人的相似性，因而，人们认为CRP是最保守的蛋白质，对物种的生存有重要意义。CRP半寿期约15h，正常人CRP的浓度很低(0.068～8.2mg/L)，但在组织损伤、急性感染发生后6～8h开始升高,24～48h达峰值，可达正常值的几百倍甚至上千倍，升高幅度与感染程度成正比，炎症治愈后浓度迅速下降，7～12天可恢复正常水平。CRP持续增高提示机体存在慢性炎症或自身免疫疾病，CRP在病毒感染时不会升高，其变化不受病人的个体差异、机体状态和治疗药物的影响。近年来研究证明，CRP与人类IgG1的重链第三恒定区(CH3)的氨基酸排列顺序非常相似，与补体C1和某些HLA抗原的氨基酸排列顺序也有相似之处。提示CRP与IgG、C1和HLA抗原具有共同起源。CRP具有与IgG和补体相似的调理和凝集作用，促进巨噬细胞的吞噬，刺激单核细胞表面的组织因子表达及其它免疫调节功能。CRP在炎症或组织损伤时皆可升高，但CRP与其他蛋白升高(2～3倍)不同，可升高100～1000倍，尽管为非特异性的，但对于细菌感染、各种炎症过程及组织坏死与损伤及其恢复期的筛检、监测、病情评估与疗效判断，都有重要的价值。近年来，存在一些关于抗C-反应蛋白单克隆抗体的研究，但得到的抗C-反应蛋白单克隆抗体的系统性评价(如抗体纯度、可重复性、批间差、抗体效价、稳定性、检测特异性等)不理想，在用于免疫诊断抗体时存在不足，不太适于制备体外诊断试剂。然而，筛选用于制备体外诊断试剂的单克隆抗体是一个复杂的过程，首先要获得很好的抗原，来制备足够多的抗体，然后对抗体进行系统的评价，获得具有临床相关性的候选抗体，再开发成检测试剂。其中，抗体纯度、可重复性、批间差、抗体效价、稳定性和临床效果等均是重要的评价因素，如抗体纯度直接保证了抗体的稳定性，纯度越高即包括各种蛋白酶在内的杂质越少；可重复性反应了本专利技术制备抗体工艺的稳定性，重复性越好，生产工艺越稳定；批次间差异始终是单克隆抗体无法回避的一个缺陷，其直接影响抗体本身功能性使用，批间差异明显最终的产品实现相对困难；抗体效价高低反映了一定浓度下与抗原反应的最低滴度，滴度越低效价越高；抗体的稳定性会直接影响最终结果的可靠性，而稳定性较差的抗体对保存条件、操作条件要求更高，从而降低了其作为诊断试剂的实用性及结果的可靠性，并不可避免地引起成本的上升；临床试验则用来说明抗体在诊断某种特定疾病时的效果。因此，为了在体外诊断方面的应用，本领域急需系统性评价结果较佳，且适用于检测C-反应蛋白的单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗C-反应蛋白单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株、含上述单克隆抗体或杂交瘤细胞株的试剂盒以及它们在检测C-反应蛋白中的用途。通过系统性评价，所述抗体在各方面均有较佳表现，从而适合作为免疫诊断试剂用于制备体外诊断试剂盒，尤其适合制备C-反应蛋白检测试剂盒。为此，专利技术人进行了大量研究，通过天然CRP抗原免疫小鼠，细胞融合后经有限系数法克隆至少4次，直到达到单克隆，从得到的众多克隆中筛选到1株能稳定分泌抗体的新型杂交瘤细胞株(Hybridoma)，此杂交瘤细胞株记作杂交瘤细胞株20F8，并于2018年8月23日将其保藏于中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:C2018177，从而完成了本专利技术。在第一个方面，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2018177。在第二个方面，本专利技术提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体能够与C-反应蛋白特异性结合。在一个实施方式中，所述单克隆抗体在反复冻融、长期保存、热加速恶劣条件下具有更优的稳定性和可靠性。在一个优选的实施方式中，所述单克隆抗体是由本专利技术的杂交瘤细胞株分泌的抗体。在第三个方面，本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术的杂交瘤细胞株或单克隆抗体。在一个具体实施方式中，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。在一个优选的实施方式中，所述试剂盒为荧光免疫试剂盒。在另一个实施方式中，所述试剂盒为微流体芯片。在第四个方面，提供了本专利技术的杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备试剂盒中的用途。在一个实施方式中，所述试剂盒是基于免疫检测的试剂盒，优选的，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。在一个优选的实施方式中，所述试剂盒为荧光免疫试剂盒。在另一个实施方式中，所述试剂盒是微流体芯片，优选的，所述微流体芯片是基于免疫检测的。在一个实施方式中，所述试剂盒用于检测C-反应蛋白。此外，还提供了本专利技术的杂交瘤细胞株或本专利技术的单克隆抗体在制备用于检测C-反应蛋白的试剂盒中的用途。本专利技术的单克隆抗体的有益效果在于，首先，其抗体纯度≥90％，满足产品特异性要求；其次，其可重复性变异系数(CV)≤15％，可满足产品生产工艺稳定；再次，其批间差异系数(CV)≤15％，可满足产品实现稳定；同时，其抗体效价比体外诊断中通常使用的商购C-反应蛋白单克隆抗体相比高出很多，有着更佳的免疫效果；然后，其具有比商购C-反应蛋白单克隆抗体更优的长期与热稳定性，也就是说延长了使用期限并能接受相对宽松的储存条件和操作条件们从而大大节约了成本；最后，临床实验表明本专利技术的单克隆抗体可用于制备C-反应蛋白检测的荧光免疫试剂盒，检测灵敏度可达0.5mg/L，检测特异性可达100％。也就是说，本专利技术的单克隆抗体在抗体纯度、可重复性、批间差、抗体效价、稳定性和检测效果等方面均展现出了很好的性能，从而本专利技术提供了一种经系统性评价可用于体外诊断且综合能力突出的抗C-反应蛋白单克隆抗体。附图说明图1示出了本专利技术的抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2的纯化后SDS-PAGE电泳图；图2示出了本专利技术抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2的纯度检测SDS-PAGE电泳图；图3示出了本专利技术抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2反复冻融后的纯度检测SDS-PAGE电泳图；图4示出了本专利技术抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2热加速后的纯度检测SDS-PAGE电泳图；图5示出了评价试剂与比对试剂的临床相关性；图6示出了本专利技术抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2制备的试剂盒对于不同样本类型的检测结果；图7示出了本专利技术抗体抗C-反应蛋白单克隆抗体2与两种商业化抗人C-反应蛋白单克隆抗体的抗体效价测定结果，其中横坐标为Log(稀释倍数)，纵坐标为OD450。具体实施方式下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本专利技术，本专利技术的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本专利技术，而非限制本专利技术。在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株20F8，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2018177。

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株20F8，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2018177。2.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株所分泌。3.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体。4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒，或者所述试剂盒是微流体芯片。5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述试剂盒为荧光免疫试剂盒。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：舒川，黄家菊，李岚敏，王磊，
申请(专利权)人：四川迈克生物新材料技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51