本发明专利技术公开了一种生产L‑木糖的重组变形假单胞菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术将合成的2‑酮基葡萄糖酸还原酶基因和来源于Corynebaterium ATCC 31090的2,5‑二酮基葡萄糖酸还原酶基因和Saccharomyces cerevisiae的丙酮酸脱羧酶基因，以双质粒系统在宿主变形假单胞菌中成功表达，获得的基因工程菌株在摇瓶上发酵56h，L‑木糖的产量可达16.2g/L，转化率达到了20.3％，在3L和15L发酵罐上分别发酵48h和44h，L‑木糖的产量分别可达37.6g/L和45.8g/L，葡萄糖转化率分别为47.0％和57.3％。该方法原料成本低，对环境无污染，且操作简单，具有重要的经济效益和社会效益。
【技术实现步骤摘要】
一种生产L-木糖的重组变形假单胞菌及其应用
本专利技术涉及一种生产L-木糖的重组变形假单胞菌及其应用，属于生物工程
技术介绍
木糖是一种五碳糖，L-木糖主要存在于植物和动物体内。木糖属于无热量甜味剂，广泛应用于食品、医药、化工等领域。食用木糖能改善人体的微生物环境，提高机体免疫能力，是糖尿病人理想的甜味剂。目前制备木糖均采用酸法提取，酸法生产木糖多采用硫酸进行水解，但酸法生产木糖有如下缺点：①生产过程中采用大量硫酸，硫酸使原料中的纤维素和半纤维素及其它糖类物质水解，产生多种副产物，影响后提取工艺和产品质量。②酸法提取木糖由于生产过程中加入大量强酸强碱液体，生产过程中产生大量生产废液，对环境造成了巨大污染。③由于酸水解的糖液杂质多，使得后处理效率低，化工程序多，对设备要求高，增加环保成本。目前，L-木糖的生产主要是由化学合成的方法，存在上述的不利因素。L-木糖也可由L-木酮糖转化生成，但是L-木酮糖属于稀有糖，价格较高，不宜作为生产L-木糖的原料。变形假单胞菌属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌。假单胞菌中葡萄糖的代谢是通过ED途径(Entner-Doudoroffpathway)完成的，在好氧条件下，葡萄糖在周质空间被氧化为葡萄糖酸，研究表明，在假单胞菌中大多数由葡萄糖产生的葡萄糖酸(约90％)被转化为2-酮基葡萄糖酸(2KGA)。目前，变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)是国内2KGA生产的主要工业用菌。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种生产L-木糖的重组菌，是以变形假单胞菌为宿主，利用双质粒表达系统表达2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因、2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述双质粒表达系统包括pME6032质粒和pBBR1MCS-2质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述pME6032质粒用于表达2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述pBBR1MCS-2质粒用于表达2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2GADH由三个亚基组成，分别表示为2GADH-1，2GADH-2，2GADH-3，其序列分别以SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示，以pME6032质粒为载体，在变形假单胞菌中表达SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示基因2GADH的三个亚基。在本专利技术的一种实施方式中，所述2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因2,5DKG来自CorynebateriumATCC31090。在本专利技术的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶基因PDC来自Saccharomycescerevisiae。在本专利技术的一种实施方式中，所述变形假单胞菌宿主包括PseudomonasplecoglossicidaCGMCC7150、PseudomonasplecoglossicidaCGMCC1.16111、PseudomonasplecoglossicidaCGMCC1.12685、PseudomonasplecoglossicidaCGMCC1.761中的任一种。本专利技术的第二个目的是提供一种生产L-木糖的重组变形假单胞菌的构建方法，所述构建方法的具体步骤为：(1)通过化学合成SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示基因，将上述序列同时与载体pME6032连接形成重组质粒pME6032-2gadh；(2)将上述重组质粒pME6032-2gadh转化至变形假单胞菌中得到重组变形假单胞菌；(3)分别扩增2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因，将上述序列同时与载体pBBR1MCS-2连接形成重组质粒pBBR1MCS-2-25dkg-pdc；(4)再将步骤(3)所得的重组质粒pBBR1MCS-2-25dkg-pdc转化至含有重组质粒pME6032-2gadh的变形假单胞菌中得到含有双质粒的重组菌。本专利技术的第三个目的是提供所述变形假单胞菌在生产L-木糖中的应用，将所述重组菌培养至OD650为0.6-0.8，加入IPTG诱导2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因、2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因的表达，以葡萄糖为底物合成L-木糖。进一步得，所述应用中的种子培养基：葡萄糖14.0-15.0g/L，玉米浆3.5-4.0g/L，尿素1.5-2.5g/L，KH2PO41.5-2.5g/L，MgS04·7H2O0.4-0.6g/L，CaCO30.8-1.2g/L，pH值7.0；所述应用中的发酵培养基：葡萄糖75.0-85.0g/L，玉米浆3.0-4.0g/L，尿素1.5-2.5g/L，KH2PO41.5-2.5g/L，MgSO4·7H2O0.4-0.6g/L，CaCO39.0-11.0g/L，pH值6.8。本专利技术取得有益效果：(1)变形假单胞菌是国内2-酮基葡萄糖酸(2KGA)生产的主要工业用菌，在工业生产中可达到较高的糖酸转化率，采用本专利技术的方法，可以将2-酮基葡萄糖酸在2-酮基葡萄糖酸脱氢酶、2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶和丙酮酸脱羧酶的催化下生成L-木糖，为L-木糖的生产提供了新的原料和方法。(2)本专利技术使用发酵法生产L-木糖的过程工艺操作简单，不会给环境带来污染，以葡萄糖为底物，摇瓶上发酵56h，L-木糖的产量可达16.2g/L，转化率达到了20.3％，在3L和15L发酵罐上分别发酵48h和44h，L-木糖的产量分别可达37.6g/L和45.8g/L，葡萄糖转化率分别为47.0％和57.3％。(3)本专利技术方法可直接用于酵母菌的生物转化实验，生产木糖醇，此种方法不需要脱毒，发酵性能好，利于木糖转化为木糖醇。因此，本专利技术制备L-木糖的方法为以后绿色工业化生产奠定基础。附图说明图1所示为重组菌株P.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc的摇瓶发酵结果。图2所示为重组菌株P.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc的3L罐分批发酵结果。图3所示为重组菌株P.plecoglossicida-2gadh-25dkg-pdc的15L罐分批发酵结果。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。L-木糖浓度通过高效液相色谱法测定。高效液相色谱条件：色谱柱为HPX-87H(Bio-RadHercules)，柱温35℃；检测器为示差折光检测器；流动相为5mMH2SO4，流速为0.6mL/min。发酵上清液通过0.22μm微孔过滤除去杂质后直接用于L-木糖的检测。葡萄糖浓度通过国产SBA-40C生物传感分析仪测定。葡萄糖转化率的计算方法：氨糖总量/总耗糖量×100％。2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2GADH亚基1序列如SEQIDNO.1所示；2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2GADH亚基2序列如SEQIDNO.2所示；2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2GADH亚基3序列如SEQIDNO.3所示；引物如表1所示，表1相关引物实施例1(1)重组质粒pME6032-2gadh的构建及鉴定通过化学合成获得序列如SEQIDNO本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产L‑木糖的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以变形假单胞菌为宿主，表达2‑酮基葡萄糖酸脱氢酶基因、2,5‑二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因的重组菌。
【技术特征摘要】
1.一种生产L-木糖的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以变形假单胞菌为宿主，表达2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因、2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因的重组菌。2.根据权利要求1所述的一种生产L-木糖的重组菌，其特征在于，以双质粒表达系统表达2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因、2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因，所述双质粒表达系统包括pME6032质粒和pBBR1MCS-2质粒。3.根据权利要求2所述的一种生产L-木糖的重组菌，其特征在于，所述pME6032质粒用于表达2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因，所述pBBR1MCS-2质粒用于表达2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因和丙酮酸脱羧酶基因。4.根据权利要求1-3任一所述的一种生产L-木糖的重组菌，其特征在于，所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶2GADH由三个亚基组成，分别如序列SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示；所述2,5-二酮基葡萄糖酸还原酶基因2,5DKG来自CorynebateriumATCC31090；所述丙酮酸脱羧酶基因PDC来自Saccharomycescerevisiae。5.根据权利要求1所述的一种生产L-木糖的重组菌，其特征在于，所述变形假单胞菌宿主包括PseudomonasplecoglossicidaCGMCC7150、PseudomonasplecoglossicidaCGMCC1.16111、PseudomonasplecoglossicidaCGMCC1.12685、PseudomonasplecoglossicidaCGMCC1.761中任一种。6.权利要求1-5所述的一种生产L-木糖的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆茜，
申请(专利权)人：上海凌凯医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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