用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法技术

本发明专利技术涉及一种用于合成谷胱甘肽的重组菌，所述的重组菌包括第一重组质粒和第二重组质粒，所述的第一重组质粒包括GS片段和pET‑22b载体片段，所述的第二重组质粒包括fliY片段和pET‑28a载体片段。本发明专利技术的重组菌可以明显地提高谷胱甘肽生产量，从而提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗，为进一步研究谷胱甘肽产量建立一种方法，为其产业化生产奠定一种基础。

【技术实现步骤摘要】
用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法。
技术介绍
谷胱甘肽(γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)是一类广泛存在于动植物和微生物体内的一类重要的非蛋白巯基化合物，具有还原型和氧化性两种状态。GSH由谷氨酸、半胱氨酸、和甘氨酸三种氨基酸通过肽键形成。GSH相对分子量为307.33，晶体呈现无色透明状，等电点为5.93，易溶于水、液氨、低浓度乙醇，但不溶于醇、醚等有机溶剂中。GSH分子具有γ-谷氨酰基和活性巯基两种基团，是GSH发挥多种重要的生理功能的基础。GSH主要以还原型状态存在于细胞当中，发挥着与多种化学物质及其代谢产物结合，清除体内氧自由基以保护细胞免受活性氧复合物损伤的功能。GSH还能保护肝细胞膜、抗氧化，解毒、维持动物体内抗坏血酸平衡的功能。除了在生理上发挥着重要的功能，GSH也被广泛应用于食品领域，其可以提高食品的保质期，抑制肉食类和鱼类的核酸分解，促进铁、无机形式硒和钙等的吸收。此外，由于GSH能延缓衰老，保护皮肤等功能，所以其化妆品领域也发挥着及其重要的作用。GSH有多种来源，但主要有下面几种方法：化学合成法、固定酶酶法生产、从谷物中分离GSH和微生物发酵法等。化学合成法由于活性产物不易分离，需要化学拆分等技术，以此该方法逐渐被别的方法所取代，从谷物中分离GSH的经济效益并不高，只是为得到GSH提供了多一种来源，酶法生产的特点是在体外利用固定化酶将三种基础氨基酸合成所需的GSH，但是由于该技术难度高，酶的活性易收到外界环境的影响，因此也逐渐被取代。与前面几种方法不同的是，生物发酵法可以有多种宿主菌生产GSH，包括大肠杆菌、酵母等。由于近年来随着生物技术的发展，多种生物体内合成GSH的酶被发现，因此可以给予GSH合成提供多种途径，故此由微生物发酵法逐渐成为了合成GSH的主要方法。微生物发酵法的特点是，将外源的GSH合成酶通过质粒导入到大肠杆菌或者酵母细胞中，使GSH合成酶过表达，大量合成的酶能够促进三种氨基酸向GSH的转化，但是由于细胞体内的氨基酸数量有限，因此需要在合成GSH的过程中加入额外的氨基酸以提高产量。另一方面，由于大量的外源氨基酸会抑制细胞对氨基酸的吸收，因此需要通过进一步对细胞进行改造，通过加入一些促进细胞对外源氨基酸吸收的基因以提高胞内的氨基酸含量。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够高效合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法。为解决以上技术问题，本专利技术采取如下技术方案：本专利技术的一个目的是提供一种用于合成谷胱甘肽的重组菌，所述的重组菌包括第一重组质粒和第二重组质粒，所述的第一重组质粒包括GS片段和pET-22b载体片段，所述的第二重组质粒包括fliY片段和pET-28a载体片段。本专利技术中的GS基因为谷胱甘肽双功能合成酶基因；本专利技术中的fliY基因为L-胱氨酸细胞周质底物结合蛋白基因。优选地，所述的GS片段位于所述的pET-22b载体片段的T7启动子之下；所述的fliY片段位于所述的pET-28a载体片段的T7启动子之下。优选地，所述的GS片段的DNA序列与SEQIDNO.1所示序列至少具有80％的同源性；进一步优选为具有85％以上的同源性，更优选为具有90％以上的同源性，再优选为具有95％以上的同源性，最优选为SEQIDNO.1所示序列。优选地，所述的fliY片段的DNA序列与SEQIDNO.2所示序列至少具有80％的同源性，进一步优选为具有85％以上的同源性，更优选为具有90％以上的同源性，再优选为具有95％以上的同源性，最优选为SEQIDNO.2所示序列。优选地，所述的第一重组质粒包括卡那霉素抗性基因片段和氨苄青霉素抗性基因片段中的一种；所述的第二重组质粒包括卡那霉素抗性基因片段和氨苄青霉素抗性基因片段中的另一种。进一步优选地，所述的第一重组质粒包括氨苄青霉素(Amp)抗性基因片段；所述的第二重组质粒包括卡那霉素(Kana)抗性基因片段；该两个抗性基因片段可用以筛选基因重组菌。优选地，所述的重组菌还包括无卡那霉素抗性和无氨苄青霉素抗性的大肠杆菌。进一步优选地，所述大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。本专利技术的另一个目的是提供一种所述的重组菌的制备方法，将所述的第一重组质粒和所述的第二重组质粒转化入无卡那霉素抗性和无氨苄青霉素抗性的大肠杆菌中，获得所述的重组菌。优选地，所述的第一重组质粒的制备方法为：A)PCR扩增获得GS片段；B)将所述的GS片段克隆入pET-22b中，得到所述的第一重组质粒。优选地，所述的第二重组质粒的制备方法为：A)PCR扩增获得fliY片段；B)将所述的fliY片段克隆入pET-28a载体片段中，得到所述的第二重组质粒。本专利技术的第三个目的是提供一种谷胱甘肽的合成方法，通过对所述的重组菌进行培养，得到所述的谷胱甘肽。优选地，所述的培养的温度为25～37℃，诱导剂的浓度为0.1～1mmol/L；诱导剂的添加时间为3～5小时，培养基中的碳源为浓度为1～50g/L的葡萄糖、蔗糖或果糖；氮源为浓度为1～50g/L的(NH4)2SO4、NH4Cl或牛肉膏；微量元素为浓度为5～500mg/L的MgSO4、ZnSO4或MnSO4；培养时间为6～24小时。进一步优选地，所述的培养的温度为25～26℃，诱导剂的浓度为0.8～1mmol/L；诱导剂的添加时间为4.5～5小时，培养基中的碳源为浓度为20～30g/L的果糖；氮源为浓度为1～25g/L的(NH4)2SO4或牛肉膏；微量元素为浓度为5～500mg/L的MgSO4、ZnSO4或MnSO4；培养时间为20～24小时。由于以上技术方案的实施，本专利技术与现有技术相比具有如下优点：本专利技术的重组菌可以明显地提高谷胱甘肽生产量，从而提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗，为进一步研究谷胱甘肽产量建立一种方法，为其产业化生产奠定一种基础。附图说明图1是pET-22b-GS质粒图谱的示意图。图2是pET-28a-fliY质粒图谱示意图，fliY位于T7强启动子下。图3是PCR扩增获GS的检测结果，其中泳道1为GSPCR扩增产物，M是蛋白标准分子量。图4是PCR扩增获fliY的检测结果，其中泳道1为fliYPCR扩增产物，M是蛋白标准分子量。图5是GS基因和fliY基因蛋白表达的SDS-PAGE结果，其中2泳道为GS和fliY蛋白，1泳道为未加诱导剂，M是蛋白标准分子量。图6是三种谷胱甘肽工程菌不同诱导条件下谷胱甘肽产量结果。图7是GSH-GS-fliY工程菌不同碳源下谷胱甘肽产量结果。图8是GSH-GS-fliY工程菌不同氮源下谷胱甘肽产量结果。图9是GSH-GS-fliY工程菌不同微量元素浓度下谷胱甘肽产量结果。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。以下实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork:CoLdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件或厂商提供的方案进行。在本专利技术的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于合成谷胱甘肽的重组菌，其特征在于：所述的重组菌包括第一重组质粒和第二重组质粒，所述的第一重组质粒包括GS片段和pET‑22b载体片段，所述的第二重组质粒包括fliY片段和pET‑28a载体片段。

【技术特征摘要】
1.一种用于合成谷胱甘肽的重组菌，其特征在于：所述的重组菌包括第一重组质粒和第二重组质粒，所述的第一重组质粒包括GS片段和pET-22b载体片段，所述的第二重组质粒包括fliY片段和pET-28a载体片段。2.根据权利要求1所述的用于合成谷胱甘肽的重组菌，其特征在于：所述的GS片段位于所述的pET-22b载体片段的T7启动子之下；所述的fliY片段位于所述的pET-28a载体片段的T7启动子之下。3.根据权利要求1所述的用于合成谷胱甘肽的重组菌，其特征在于：所述的GS片段的DNA序列与SEQIDNO.1所示序列至少具有80%的同源性；所述的fliY片段的DNA序列与SEQIDNO.2所示序列至少具有80%的同源性。4.根据权利要求1所述的用于合成谷胱甘肽的重组菌，其特征在于：所述的第一重组质粒包括卡那霉素抗性基因片段和氨苄青霉素抗性基因片段中的一种；所述的第二重组质粒包括卡那霉素抗性基因片段和氨苄青霉素抗性基因片段中的另一种。5.根据权利要求1所述的用于合成谷胱甘肽的重组菌，其特征在于：所述的重组菌还包括无卡那霉素抗性和无氨苄青霉素抗性的大肠杆菌。6.根据权利要求5所述的用于合成谷胱甘肽的重组菌，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：许激扬，赵玉成，王郑隆，徐继嗣，
申请(专利权)人：张家港市华天药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32