用于DNA编辑的系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了用于DNA编辑的系统及其应用。本发明专利技术公开的用于DNA编辑的系统包括crRNA与tracrRNA，crRNA为式Ⅰ所示RNA：Nx‑ncrRNA(式Ⅰ)，Nx为间隔序列，ncrRNA为序列表中SEQ ID NO.1‑4所示的RNA，tracrRNA为序列表中SEQ ID NO.5‑8所示的RNA。本发明专利技术的用于DNA编辑的系统中的元件——crRNA与tracrRNA序列短，易于通过化学合成获得，有利于提升RNA的纯度和规模生产，并简化系统的制备与应用，可以用于编辑目的DNA。

【技术实现步骤摘要】
用于DNA编辑的系统及其应用
本专利技术涉及生物
中，用于DNA编辑的系统及其应用。
技术介绍
CRISPR–Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。根据功能元件的不同，CRISPR–Cas系统可以分为Ⅰ类系统、Ⅱ类系统和Ⅲ类系统。这三类系统又可以根据其编码Cas蛋白的基因不同而分为更多的亚类。Ⅰ类系统和Ⅲ类CRISPR–Cas系统只需要crRNA和Cas蛋白两种元件的参与，而Ⅱ类CRISPR–Cas系统包括crRNA、tracrRNA和Cas蛋白三种元件。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的靶位点剪切双链DNA。Cas9有两个关键的结构域：HNH和RuvC，它们分别切开DNA双链中的一条单链。产生DNA双链断裂(DSB)，细胞启动修复机制，细胞可通过非同源末端连接(NHEJ)这种不精确的修复方式产生基因定点突变，也可以通过同源重组(HR)方式修复实现精确的基因定点插入或基因替换。Cas9已经在细菌、人类细胞、斑马鱼和小鼠中成功进行基因组工程研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于DNA编辑的CRISPR/Cas系统。本专利技术首先提供了一种用于DNA编辑的系统，所述系统为CRISPR-Cas系统，包括甲或乙：甲、下述N1)和N2)：N1)名称为RNA-2的RNA或与所述RNA-2相关的生物材料；N2)名称为RNA-1的RNA或与所述RNA-1相关的生物材料；所述RNA-2为式Ⅰ所示RNA；Nx-ncrRNA式Ⅰ；其中，Nx为CRISPR/Cas系统中的间隔序列(Spacer)；所述ncrRNA为如下a1)至a4)中的任一种：a1)序列表中SEQIDNO.1所示的RNA；a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；a3)与a1)或a2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；a4)序列表中SEQIDNO.1所示的RNA的修饰物；与所述RNA-2相关的生物材料为下述A1)至A5)中的任一种：A1)编码所述RNA-2的DNA分子；A2)含有A1)所述DNA分子的表达盒；A3)含有A1)所述DNA分子的重组载体、或含有A2)所述表达盒的重组载体；A4)含有A1)所述DNA分子的重组微生物、或含有A2)所述表达盒的重组微生物、或含有A3)所述重组载体的重组微生物；A5)含有A1)所述DNA分子的细胞系、或含有A2)所述表达盒的细胞系；所述RNA-1为如下b1)至b4)中的任一种：b1)序列表中SEQIDNO.5所示的RNA；b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；b3)与b1)或b2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；b4)序列表中SEQIDNO.5所示的RNA的修饰物；与所述RNA-1相关的生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：B1)编码所述RNA-1的DNA分子；B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒；B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述DNA分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；B5)含有1)所述DNA分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系；所述ncrRNA与所述RNA-1部分片段互补形成包括茎区和环区的结构；乙、所述RNA-2。所述RNA-2的Nx部分位于5′端，所述RNA-2的ncrRNA部分位于3′端，二部分通过核苷间键连接。Nx为RNA序列，与进行编辑的目的DNA的片段互补，满足为CRISPR/Cas系统中的间隔序列的要求。N可为核糖核苷酸或核糖核苷酸修饰物；x为N的个数。其中，x为非零自然数。x具体可为下述e1)-e3)中的任一种：e1)15～22间的任一整数；e2)19～21间的任一整数；e3)20。所述RNA-2可通过ncrRNA与所述RNA-1的部分片段形成复合物，CRISPR-Cas系统中的Cas蛋白(即Cas核酸酶)可与该复合物结合实现对DNA的编辑。所述添加一个或几个核苷酸具体可为添加一至十个核苷酸。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的SEQIDNO.1或SEQIDNO.5所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的SEQIDNO.1或SEQIDNO.5进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术的SEQIDNO.1或SEQIDNO.5的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要且具有相同功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。所述细胞系不包括繁殖材料。上述系统中，a2)所述RNA可为如下a21)至a23)中的任一种：a21)长度为12-14nt的RNA；a22)长度为12-16nt的RNA；a23)长度为12-18nt的RNA。b2)所述RNA可为如下b21)至b24)中的任一种：b21)长度为64-66nt的RNA；b22)长度为64-68nt的RNA；b23)长度为64-70nt的RNA；b24)长度为64-86nt的RNA。所述核糖核苷酸可为A、U、C或G。所述核糖核苷酸修饰物可为对A、U、C或G在核糖、磷酸骨架和/或碱基进行修饰得到的物质；所述修饰物为对所述RNA中的至少一个核苷酸在核糖、磷酸骨架和/或碱基进行修饰得到的物质。所述修饰可为2′-O-甲基修饰、2′-脱氧修饰、2′-氟代修饰或胆固醇修饰。所述DNA可为下述M1)-M5)中的任一种：M1)真核生物的DNA；M2)动物的DNA；M3)哺乳动物的DNA；M4)人的DNA；M5)小鼠的DNA。上述系统中，a21)所述RNA可为序列表中SEQIDNO.2所示的RNA；a22)所述RNA可为序列表中SEQIDNO.3所示的RNA；a23)所述RNA可为序列表中SEQIDNO.4所示的RNA。b21)所述RNA可为序列表中SEQIDNO.6所示的RNA；b22)所述RNA可为序列表中SEQIDNO.7所示的RNA；b23)所述RNA可为序列表中SEQIDNO.8所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于DNA编辑的系统，包括甲或乙：甲、下述N1)和N2)：N1)名称为RNA‑2的RNA或与所述RNA‑2相关的生物材料；N2)名称为RNA‑1的RNA或与所述RNA‑1相关的生物材料；所述RNA‑2为式Ⅰ所示RNA；Nx‑ncrRNA式Ⅰ；其中，Nx为CRISPR/Cas系统中的间隔序列；所述ncrRNA为如下a1)至a4)中的任一种：a1)序列表中SEQ ID NO.1所示的RNA；a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；a3)与a1)或a2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；a4)序列表中SEQ ID NO.1所示的RNA的修饰物；与所述RNA‑2相关的生物材料为下述A1)至A5)中的任一种：A1)编码所述RNA‑2的DNA分子；A2)含有A1)所述DNA分子的表达盒；A3)含有A1)所述DNA分子的重组载体、或含有A2)所述表达盒的重组载体；A4)含有A1)所述DNA分子的重组微生物、或含有A2)所述表达盒的重组微生物、或含有A3)所述重组载体的重组微生物；A5)含有A1)所述DNA分子的细胞系、或含有A2)所述表达盒的细胞系；所述RNA‑1为如下b1)至b4)中的任一种：b1)序列表中SEQ ID NO.5所示的RNA；b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；b3)与b1)或b2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；b4)序列表中SEQ ID NO.5所示的RNA的修饰物；与所述RNA‑1相关的生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：B1)编码所述RNA‑1的DNA分子；B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒；B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述DNA分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；B5)含有1)所述DNA分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系；所述ncrRNA与所述RNA‑1部分片段互补；乙、所述RNA‑2。...

【技术特征摘要】
1.用于DNA编辑的系统，包括甲或乙：甲、下述N1)和N2)：N1)名称为RNA-2的RNA或与所述RNA-2相关的生物材料；N2)名称为RNA-1的RNA或与所述RNA-1相关的生物材料；所述RNA-2为式Ⅰ所示RNA；Nx-ncrRNA式Ⅰ；其中，Nx为CRISPR/Cas系统中的间隔序列；所述ncrRNA为如下a1)至a4)中的任一种：a1)序列表中SEQIDNO.1所示的RNA；a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；a3)与a1)或a2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；a4)序列表中SEQIDNO.1所示的RNA的修饰物；与所述RNA-2相关的生物材料为下述A1)至A5)中的任一种：A1)编码所述RNA-2的DNA分子；A2)含有A1)所述DNA分子的表达盒；A3)含有A1)所述DNA分子的重组载体、或含有A2)所述表达盒的重组载体；A4)含有A1)所述DNA分子的重组微生物、或含有A2)所述表达盒的重组微生物、或含有A3)所述重组载体的重组微生物；A5)含有A1)所述DNA分子的细胞系、或含有A2)所述表达盒的细胞系；所述RNA-1为如下b1)至b4)中的任一种：b1)序列表中SEQIDNO.5所示的RNA；b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；b3)与b1)或b2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；b4)序列表中SEQIDNO.5所示的RNA的修饰物；与所述RNA-1相关的生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：B1)编码所述RNA-1的DNA分子；B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒；B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述DNA分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；B5)含有1)所述DNA分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系；所述ncrRNA与所述RNA-1部分片段互补；乙、所述RNA-2。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：a2)所述RNA为如下a21)至a23)中的任一种：a21)长度为12-14nt的RNA；a22)长度为12-16nt的RNA；a23)长度为12-18nt的RNA；和/或，b2)所述RNA为如下b21)至b24)中的任一种：b21)长度为64-66nt的RNA；b22)长度为64-68nt的RNA；b23)长度为64-70nt的RNA；b24)长度为64-86nt的RNA；和/或，所述核糖核苷酸修饰物为对核糖核苷酸在核糖、磷酸骨架和/或碱基进行修饰得到的物质；所述修饰物为对所述RNA中的至少一个核苷酸在核糖、磷酸骨架和/或碱基进行修饰得到的物质；和/或，所述DNA为下述M1)-M5)中的任一种：M1)真核生物的DNA；M2)动物的DNA；M3)哺乳动物的DNA；M4)人的DNA；M5)小鼠的DNA。3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于：a21)所述RNA为序列表中SEQIDNO.2所示的RNA；a22)所述RNA为序列表中SEQIDNO.3所示的RNA；a23)所述RNA为序列表中SEQIDNO.4所示的RNA；和/或，b21)所述RNA为序列表中SEQIDNO.6所示的RNA；b22)所述RNA为序列表中SEQIDNO.7所示的RNA；b23)所述RNA为序列表中SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：张必良，曹亮，克雷格·梅洛，
申请(专利权)人：广州市锐博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44