本发明专利技术涉及一种表达动脉粥样硬化炎症活动的环状RNA及其应用，其特征在于所述的环状RNA为hsa_circ_0007478，且其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本申请hsa_circ_0007478在人动脉粥样硬化中的表达及其对动脉粥样硬化生物学功能的调节作用的研究，提供基hsa_circ_0007478基因及其表达产物在动脉粥样硬化的诊断和治疗方面的用途。
【技术实现步骤摘要】
一种表达动脉粥样硬化炎症活动的环状RNA及其应用
本专利技术涉及一种环状RNA，具体涉及一种环状hsa_circ_0007478的用途。
技术介绍
动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)及其所致冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是心血管最常见疾病，是人类致死的主要原因之一。动脉粥样硬化是冠心病形成及发展的主要病理过程，巨噬细胞作为斑块组织中的主要构成成分以及炎症因子的主要来源，在动脉粥样硬化斑块的进展过程中发挥了关键作用。巨噬细胞能合成并分泌多种细胞因子，而这些细胞因子又进一步的刺激巨噬细胞分泌多种炎症因子，持续的炎症状态加剧了斑块的不稳定性，不稳定冠状动脉粥样硬化斑块易发生破裂或破溃，表面血栓形成，是造成急性冠脉综合征(包括不稳定性心绞痛、急性心肌梗死、猝死)的主要机制，而急性冠脉综合征则是冠心病致死、致残的主要原因。在人类基因组中，大约有98％转录体并不编码蛋白质，而这种非编码RNA却在细胞生长、分化和人类疾病中扮演着重要的角色。其中，circRNA是一类能够在转录后水平调节基因mRNA表达的一组非蛋白编码RNA分子，它具有闭合的环形结构，具有如下特点：1、环状RNA较稳定，其封闭环状结构不易被核酸外切酶RNaseR降解；2、种属之间高度保守；3、形成方式主要为外显子环化；4、在人体细胞中广泛表达，甚至超过其线性异构体的10倍之多；5、大部分存在于真核细胞的胞质中，具有组织、时序和疾病特异性；6、具有miRNA海绵吸附功能，可充当竞争内源性内源RNA，与miRNA结合，从而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平。近年来，随着对circRNA在生物个体发育过程中的基因表达调控作用的认识，使得circRNA的研究倍受关注，并成为当前生命科学理论和应用研究的热点。因此研究动脉粥样硬化炎症活动过程中circRNAs的变化与作用有助于我们进一步的认识动脉粥样硬化的病理生理过程，为我们临床预防和治疗动脉粥样硬化性心脏病提供新的思路，也为新型的药物开发与应用提供新的作用靶点。然而到底有哪些circRNAs参与动脉粥样硬化炎症活动的过程中并不清楚，而且这些circRNAs所行使的功能更无从了解。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供对hsa_circ_0007478在人动脉粥样硬化中的表达及其对动脉粥样硬化生物学功能的调节作用的研究，提供基hsa_circ_0007478基因及其表达产物在动脉粥样硬化的诊断和治疗方面的用途。本专利技术提供了一种能够表达动脉粥样硬化炎症活动的环状RNA，其特征在于，所述的环状RNA为hsa_circ_0007478，且其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了一种动脉粥样硬化诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含能够扩增如权利要求1所述的环状hsa_circ_0007478的引物，所述扩增引物为由如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的DNA序列组成的引物对。本专利技术提供了一种hsa_circ_0007478基因作为靶基因在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的用途，其特征在于，所述hsa_circ_0007478基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了一种抑制hsa_circ_0007478基因表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA核苷酸序列如SEQIDNO.16所示且能够用于抑制hsa_circ_0007478。本专利技术提供了一种针对动脉粥样硬化的干扰药物，其特征在于，所述的干扰药物包括如上述的siRNA。为了得到上述实验结果，本身采用了如下的实验方案：一种动脉粥样硬化炎症活动相关circRNAs的筛选方法及其验证，具体按照以下步骤实施：步骤1、构建体外ox-LDL刺激的巨噬细胞模型，采用ArraystarHumancircRNA芯片筛选出ox-LDL刺激的巨噬细胞过程中差异表达的circRNAs；步骤2、构建体外ox-LDL刺激的巨噬细胞模型，采用实时定量PCR验证芯片的结果。步骤3、构建体外ox-LDL刺激的巨噬细胞模型，采用siRNA干扰circRNA(hsa_circ_0007478)，证实hsa_circ_0007478可以减轻经ox-LDL刺激的巨噬细胞的炎症反应。本专利技术的特点还在于，步骤1构建体外ox-LDL刺激的巨噬细胞模型，模拟动脉粥样硬化炎症反应的病理生理过程，采用ArraystarHumancircRNA芯片筛选出ox-LDL刺激的巨噬细胞过程中差异表达的circRNAs的具体步骤为：步骤1.1、ox-LDL刺激的巨噬细胞模型构建：共分两组：巨噬细胞组(对照组)和ox-LDL刺激的巨噬细胞组。将人单核细胞株THP-1，经PMA诱导48小时形成巨噬细胞，收集正常培养的巨噬细胞以及经ox-LDL刺激后的巨噬细胞，建立ox-LDL刺激的巨噬细胞模型，对照组细胞为将人单核细胞株THP-1经PMA诱导43小时形成巨噬细胞；步骤1.2、在培养板中加入1mlTRIZOL试剂裂解细胞，裂解时反复用枪吹打10余次；在TRIZOL中加入0.2ml氯仿，上下振荡10秒，室温下静置5分钟，然后于4℃下，12000rpm高速离心15分钟，小心吸取上层水相移入新的无RNA酶离心管中；加入上述中上层水相等体积的异丙醇，混匀后，-20℃条件下静置过夜，然后4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；在上述沉淀中加入质量分数为75％的乙醇1ml，反复颠倒数次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清；再次4℃下12000rpm离心2分钟；弃上清，室温下干燥1～2分钟，加10μl无RNA酶水溶解，得到RNA提取液，-80℃保存备用；提取上述两组细胞总RNA，用Agilent公司的快速Amp标记试剂盒标记RNA，与芯片上的探针杂交；步骤1.3、使用AgilentScannerG2505C软件收集芯片的数据，用AgilentFeatureExtractionsoftware(version11.0.1.1)软件分析数据，筛选出变化倍数大于1.5倍，P值小于0.05的差异表达的circRNA(图1所示)；步骤1.4、采用GO分析和Pathway分析挑选出与动脉粥样硬化炎症活动过程有着密切关系的circRNAs，即hsa_circ_0007478，hsa_circ_0007085，hsa_circ_0092327和hsa_circ_0082139，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-SEQIDNO.4所示。步骤2构建体外ox-LDL刺激的巨噬细胞模型，采用实时定量PCR验证芯片的结果，具体步骤如下：步骤2.1、实验分组同上：将人单核细胞株THP-1，经PMA诱导48小时形成巨噬细胞，收集正常培养的巨噬细胞以及经ox-LDL刺激后的巨噬细胞，建立ox-LDL刺激的巨噬细胞模型，对照组细胞为将人单核细胞株THP-1经PMA诱导48小时形成巨噬细胞；步骤2.2、将步骤2.1中处理后的细胞中加入1mlTRIZOL试剂裂解，再经过上述步骤1.2得到RNA提取液，-80℃保存备用；用逆转录试剂对RNA提取液进行逆转录反应得到cDNA；步骤2.3、对步骤2.2中的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量PCR仪检测扩增结果，结果表明与动脉粥样硬化炎本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种能够表达动脉粥样硬化炎症活动的环状RNA，其特征在于，所述的环状RNA为hsa_circ_0007478，且其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种能够表达动脉粥样硬化炎症活动的环状RNA，其特征在于，所述的环状RNA为hsa_circ_0007478，且其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种动脉粥样硬化诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含能够扩增如权利要求1所述的hsa_circ_0007478的引物。3.根据权利要求2所述的动脉粥样硬化诊断试剂盒，其特征在于，所述扩增引物为由如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的DNA序列组成的引物对。4.hsa_c...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄周青，叶浡之，黄伟剑，林璐，施翔翔，周浩，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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