翅发育相关基因decapentaplegic的dsRNA及其在害虫防治中的应用制造技术

本发明专利技术公开了翅发育相关基因decapentaplegic的dsRNA及其在害虫防治中的应用。本发明专利技术首次对橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic设计引物并合成了dsRNA，且运用饲喂法对橘小实蝇decapentaplegic基因进行RNAi的应用，在保证干扰效率的前提下得到翅发育畸形的表型。本发明专利技术解决了注射导入dsRNA在田间难以操作的问题，为探索直接喷施RNA制剂防控橘小实蝇做好铺垫，对有效防控橘小实蝇的入侵和扩散，保护我国农业生产、生态安全具有良好的经济和社会效益。

DsRNA of wing development related gene decapentaplegic and its application in pest control

The invention discloses dsRNA of decapentaplegic, a wing development related gene, and its application in pest control. The present invention designs primers and synthesizes dsRNA for the first time for decapentaplegic gene of fruit fly, and applies RNAi to decapentaplegic gene of fruit fly by feeding method to obtain the phenotype of wing development deformity on the premise of ensuring interference efficiency. The invention solves the problem that the injection of dsRNA is difficult to operate in the field, paves the way for exploring the prevention and control of fruit fly by direct spraying of RNA preparation, effectively prevents and controls the invasion and spread of fruit fly, and protects the agricultural production and ecological security of our country with good economic and social benefits.

【技术实现步骤摘要】
翅发育相关基因decapentaplegic的dsRNA及其在害虫防治中的应用
本专利技术涉及生物技术及农业害虫防治领域，具体涉及翅发育相关基因decapentaplegic(dpp)的dsRNA及其在害虫防治中的应用，特别涉及在橘小实蝇防治中的应用。
技术介绍
橘小实蝇(BactroceradorsalisHendel)又名东方果实蝇，隶属于双翅目(Diptera)、实蝇科(Tephritidae)、果实蝇属(Bactrocera)，是多种热带、亚热带水果和蔬菜的重要害虫。橘小实蝇为杂食性害虫，寄主范围广，可危害柑橘、番石榴、杨桃、芒果、香蕉、茄子、辣椒、瓜类等40多科250多种水果和蔬菜(邓志声，2001；商鸿生，1997)。该虫以雌虫产卵于水果、蔬菜的果实表皮内，幼虫在果实内部取食为害，造成果实腐烂、落果，不仅对果蔬生产构成严重危害，而且因其卵和幼虫可随果实移运而传带，给进出口贸易带来严重影响。目前，国内外普遍采用套袋、性诱及施用化学农药等措施控制橘小实蝇的田间危害，但套袋的物理方法费时费力且化学农药也会带来“3R”问题，难以实现高效治理。近年来，基于遗传控制的橘小实蝇雄虫不育技术(SIT)为防治重要经济实蝇开辟了一条新途径，得到一定发展，但这种措施工作量大且需要连续释放不育雄虫。因此，对控制橘小实蝇扩散为害的研究需要寻求更有效、更可持续的防治方法。昆虫翅的形成利于其迁移并扩大生活范围，对橘小实蝇翅发育相关基因的研究可以探索从遗传学角度防治橘小实蝇的方法。随着对果蝇等模式昆虫的深入研究，与翅发育有关的信号通路逐渐被揭示，这些信号通路基因参与调控翅的发育，对于探索非模式昆虫翅发育机理提供参考意义。幼虫时期的翅称为翅芽，果蝇翅芽划分为前(anterior，A)、后(posterior，P)、背(dorsal，D)、腹(ventral，V)4个隔间(Bryant，1970；Garcia-Bellido&Merriam，1971b；Garcia-Bellidoetal.，1973)，分别由A/P隔间边界和D/V隔间边界隔开，边界线处细胞形成A/P和D/V组织中心，指导翅在2个轴向上的发育(Klein，2001)。Decapentaplegic(简称dpp)作为一种器官成形素，在翅芽前隔间边界细胞中制造并分泌出去，沿A/P轴线方向形成浓度梯度，调控下游靶标基因的表达范围并指导翅在该方向上的发育。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指由外源或内源的双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引起基因特异性降解的现象，又被称之为基因沉默(genesilencing)或基因敲除(knockout)，是一种转录后的基因调控方法。随着对其作用机制的研究的发展，RNAi技术在昆虫控制领域，逐渐成为害虫数量控制和种群保护等方面的研究热点(赵洁和刘小宁，2015)。同时该技术具有特异性、高效性、稳定性，给基因功能研究、生物基因工程、医药研究提供了一种全新的方法(赵洁和刘小宁，2015)。RNAi技术现已被应用于研究信号转导通路、基因治疗、基因表达调控、基因敲除、基因改造等多个领域(王军等，2007)。研究表明，在赤拟谷盗中用RNAi抑制ubx和abd-A两个基因的表达，在中胸至第8腹节的10个体节均出现了鞘翅盘(Tomoyasuetal.，2005)，对赤拟谷盗晚期幼虫显微注射wg基因的dsRNA后，成虫翅宽度减小，翅间距增大，且羽化过程受到严重影响。人工合成的dsRNA作为一种RNA制剂在未来害虫防治中具有广阔的发展和应用前景。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种dsRNA。本专利技术提供的dsRNA为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。本专利技术的第二个目的是提供编码上述dsRNA的DNA分子。本专利技术提供的编码上述dsRNA的DNA分子的核苷酸序列具体为序列表中序列2。本专利技术的第三个目的是提供含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。本专利技术的第四个目的是提供上述dsRNA或上述DNA分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系的新用途。本专利技术提供了上述dsRNA或上述DNA分子或上述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下a1)-a8)中任一种中的应用：a1)防治橘小实蝇；a2)制备防治橘小实蝇的产品；a3)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；a4)制备防控橘小实蝇的入侵和/或扩散的产品；a5)抑制橘小实蝇翅发育；a6)制备抑制橘小实蝇翅发育的产品；a7)抑制橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic表达；a8)制备抑制橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic表达的产品。本专利技术的第五个目的是提供一种抑制橘小实蝇翅发育的方法。本专利技术提供的抑制橘小实蝇翅发育的方法是将抑制橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic表达的物质导入橘小实蝇，从而实现抑制橘小实蝇翅发育。上述方法中，所述抑制橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic表达的物质为上述dsRNA。上述方法中，所述导入的方式为饲喂。所述饲喂的方法具体可为将dsRNA与纳米载体和饲料混匀，得到混合物，将所述混合物饲喂橘小实蝇。所述dsRNA、纳米载体和饲料的配比为1μg∶(1-1.5)μL∶(0.05-0.1)g，具体地，所述dsRNA、纳米载体和饲料的配比为1μg∶1.4μL∶0.075g。上述方法中，所述橘小实蝇可为1龄橘小实蝇幼虫。本专利技术的第六个目的是提供上述方法的新用途。本专利技术提供了上述方法在如下b1)-b3)中任一种中的应用：b1)防治橘小实蝇；b2)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；b3)抑制橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic表达。本专利技术的第七个目的是提供一种产品。本专利技术提供的产品的活性成分为如下c1)或c2)：c1)上述dsRNA；c2)上述DNA分子；所述产品具有如下d1)-d4)中任一种功能：d1)防治橘小实蝇；d2)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；d3)抑制橘小实蝇翅发育；d4)抑制橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic表达。本专利技术的第八个目的是提供抑制橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic表达的物质。本专利技术提供的抑制橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic表达的物质为如下e1)-e3)中任一种：e1)上述dsRNA；e2)上述DNA分子；e3)含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。本专利技术首次对橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic设计引物并合成了dsRNA，且运用饲喂法对橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic进行RNA干扰，在保证干扰效率的前提下得到翅发育畸形的表型。本专利技术从翅发育的角度对靶标基因进行敲除，使害虫不具飞行能力，无法扩散为害，不仅解决了注射导入dsRNA在田间难以操作的问题，使RNA制剂方便应用于害虫防治领域，为今后研究直接喷施的RNA制剂来防控橘小实蝇打下基础，也对有效防控橘小实蝇的入侵和扩散，保护我国农业生产、生态安全以及人类健康具有良好的经济、社会效益。附图说明图1为空白对照组(CK)和dsGFP对照组橘小实蝇表型。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。

【技术特征摘要】
1.一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。2.编码权利要求1所述dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中序列2。3.含有权利要求2所述的DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。4.权利要求1所述的dsRNA或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在如下a1)-a8)中任一种中的应用：a1)防治橘小实蝇；a2)制备防治橘小实蝇的产品；a3)防控橘小实蝇的入侵和/或扩散；a4)制备防控橘小实蝇的入侵和/或扩散的产品；a5)抑制橘小实蝇翅发育；a6)制备抑制橘小实蝇翅发育的产品；a7)抑制橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic表达；a8)制备抑制橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic表达的产品。5.一种抑制橘小实蝇翅发育的方法，是将抑制橘小实蝇翅发育基因decapentaplegic表达的物质导入橘小实蝇，从而实现抑制橘小实蝇翅发育。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志红，郭韶堃，沈杰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11