ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。本发明专利技术以ZEB1为研究对象，合成ZEB1干扰小片段，转染心脏成纤维细胞，发现ZEB1促进心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成，还通过控制其表达的miR‑590‑3p在心脏成纤维细胞中的功能来进行研究；本发明专利技术干扰ZEB1后，验证能够回复由miR‑590‑3p引起的细胞功能表型，表明ZEB1在心脏成纤维细胞中是miR‑590‑3p的一个重要功能靶标，miR‑590‑3p可通过ZEB1来调节成纤维细胞的功能。本发明专利技术通过ZEB1和其靶向的miRNA在心脏成纤维细胞的应用，对于研究心肌梗死后的纤维化机制具有很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用
本专利技术属于细胞工程和基因工程
，特别涉及一种ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。
技术介绍
心肌梗死状动脉的血液流动不畅，心肌长时间缺氧、缺血而导致的局部心肌坏死。在心肌梗死发生的早期，细胞外基质合成和沉积能加强心脏的收缩力，形成瘫痕防止心脏破裂，在一定程度上改善心脏功能；但是在疾病的后期，由于细胞外基质的合成过多，在心脏组织中大量积累，导致心肌纤维化的发生。心脏成纤维细胞在心肌纤维化过程中大量增殖，同时分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞合成大量胶原等成分堆积于心肌间，致使心肌组织中胶原纤维降解异常、各种胶原比例失衡和间质与血管周围的蛋白积累过度。因此，心脏成纤维细胞是心肌纤维化过程的重要效应细胞，它的功能改变能影响心肌纤维化进程。锌指E盒结合的同源盒蛋白1(ZincfingerE-boxbindinghomeobox1，ZEB1)位于人染色体10p11.2上，是非常重要的一种细胞核转录因子。TGF-β是重要的致纤维化因子，ZEB1的基因结构上含有一个能与Smad蛋白结合的区域，可与磷酸化的Smad蛋白结合，从而促进TGF-β的活化转录。此结果说明，ZEB1可能参与调控器官的纤维化过程。研究发现在肝纤维化的大鼠模型中静脉注射重组ZEB1蛋白，HE和Masson染色结果显示，炎症与肝纤维化程度有所加重，纤维间距变宽，并且TGF-β表达水平上调，这些结果说明了ZEB1也许可以通过激活化某些途径促进TGF-β的转录进而促进大鼠肝纤维化进程。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度约为22个核苷酸，可通过与信使核糖核酸(MessengerRibonucleicAcid，mRNA)的3′非翻译区(untranslatedregion，UTR)不同程度的互补配对，诱导靶基因mRNA降解或抑制翻译，从而在转录后水平调控靶基因的表达。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。以确定ZEB1对人心脏成纤维细胞功能的调节作用。通过基因工程技术改变ZEB1基因在成纤维细胞的表达量，进而影响成纤维细胞增殖、迁移、胶原合成与分化；通过生物信息学软件预测该基因靶向的miRNA，研究该miRNA的功能，来达到ZEB1在人心脏成纤维细胞中应用的目的。本专利技术的另一目的在于提供抑制ZEB1基因的小干扰RNA片段(siRNA)。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。本专利技术提供抑制ZEB1基因的siRNA，序列如下：si-ZEB1-1：5'-GGCAAGUGUUGGAGAAUAA-3'；si-ZEB1-2：5'-CCAGAAAUACACAGGGUUA-3'；si-ZEB1-3：5'-GGACAGCACAGUAAAUCUA-3'；本专利技术提供靶向ZEB1基因的miRNA，序列如下：miR-590-3p：5'-UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU-3'；在心脏成纤维细胞中补充抑制ZEB1基因的小干扰RNA片段后，能回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型。验证结果如下：1、合成3对干扰ZEB1基因的小片段/对照(si-ZEB1/si-ZEB1-NC)，转染干扰小片段到成纤维细胞中(转染浓度为50nM)，qRT-PCR检测其干扰效率，最终确定干扰效果较好的si-ZEB1-2小片段进行后续实验。si-ZEB1-1：5'-GGCAAGUGUUGGAGAAUAA-3'；si-ZEB1-2：5'-CCAGAAAUACACAGGGUUA-3'；si-ZEB1-3：5'-GGACAGCACAGUAAAUCUA-3'；2、干扰ZEB1基因小片段(si-ZEB1-2)转染心脏成纤维细胞，研究其对人心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成的应用。通过EdU法、Transwell、qRT-PCR与Westernblotting分别检测ZEB1受到si-ZEB1-2小片段干扰后心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成情况，发现ZEB1促进纤维细胞增殖与迁移，促进心脏成纤维细胞分化为肌成纤维细胞与合成Ⅰ型与Ⅲ型胶原。3、通过TargetScan、MiRanda、RNAhybrid3个生物信息学软件预测调控ZEB1的miRNA，发现ZEB1的3'UTR区含有miR-590-3p结合位点，分别扩增ZEB1的野生型3'UTR区及与miR-590-3p种子区结合位点突变的突变型3'UTR区，并将其连接到pmirGLO真核表达载体中，通过双荧光素酶报告基因系统检测，发现ZEB1野生型(WT-ZEB1)3'UTR上游报告基因活性受到miR-590-3p调控而表达量下降，而ZEB1突变型(MUT-ZEB1)3'UTR上游报告基因活性不受miR-590-3p调控。通过qRT-PCR与Westernblotting验证，ZEB1在蛋白水平受miR-590-3p调控(miR-590-3pmimic的转染浓度为25nM)。4、ZEB1回复miR-590-3p的功能验证。在心脏成纤维细胞中共转染miR-590-3pinhibitor与si-ZEB1-2后，检测能否回复由miR-590-3p引起的细胞迁移改变。通过Transwell检测结果显示，miR-590-3pinhibitor的促细胞迁移功能可以被si-ZEB1-2回复。本专利技术以ZEB1为研究对象，采用细胞生物学方法研究其在人心脏成纤维细胞中的应用。关键点和欲保护点：(1)ZEB1在人心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成中的应用；(2)通过靶基因回复验证，即在心脏成纤维细胞中补充抑制ZEB1基因的小干扰RNA片段(si-ZEB1-2)后，验证能否回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型。成纤维细胞的增殖、迁移、分化与合成胶原的能力是影响心肌纤维化的重要机制，本专利技术第一次证实ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。本专利技术补充si-ZEB1-2能够回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型，进一步表明ZEB1在成纤维细胞中是miR-590-3p的一个重要功能靶标，miR-590-3p可以通过ZEB1来调节人心脏成纤维细胞的功能。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术以ZEB1为研究对象，合成ZEB1干扰小片段，转染心脏成纤维细胞，发现ZEB1促进心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成，还通过控制其表达的miR-590-3p在心脏成纤维细胞中的功能来进行研究；本专利技术干扰ZEB1后，验证能够回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型，表明ZEB1在心脏成纤维细胞中是miR-590-3p的一个重要功能靶标，miR-590-3p可通过ZEB1来调节成纤维细胞的功能。本专利技术通过ZEB1和其靶向的miRNA在心脏成纤维细胞的应用，对于研究心肌梗死后的纤维化机制具有很好的应用价值。附图说明图1是qRT-PCR检测3对ZEB1干扰小片段的干扰效率结果图。图2是ZEB1干扰小片段(si-ZEB1-2)调控心脏成纤维细胞增殖。图3是ZEB1干扰小片段(si-ZEB1-2)调控心脏成纤维细胞迁移。图4是ZEB1干扰小片段(si-ZE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。

【技术特征摘要】
1.ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。2.根据权利要求1中所述的ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用，其特征在于：抑制ZEB1基因的siRNA，序列如下：si-ZEB1-1：5'-GGCAAGUGUUGGAGAAUAA-3'。3.根据权利要求1中所述的ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用，其特征在于：抑制ZEB1基因的siRNA，序列如下：si-ZEB1-2：5'-CCAGAAAUACACAGGGUUA-3'。4.根据权利要求1中所述的ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张豪，王希龙，温丽娟，潘金春，黄韧，杨丰华，龚宝勇，谭伟江，
申请(专利权)人：华南农业大学，广东省实验动物监测所，
类型：发明
国别省市：广东,44