一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术提供能低成本生产对羟基肉桂酸的重组菌；所述重组菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L‑乳酸脱氢酶、NADH氧化酶；进一步地，本发明专利技术的重组菌还敲除了酚类物质分解基因，强化表达了乳酸转运基因、苯酚转运基因、辅酶合成相关基因中的任意一种或多种。本发明专利技术实现了对羟基肉桂酸的高效生产，且方法过程简单、杂质少，具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用
本专利技术涉及一种工程菌及其在生产对羟基肉桂酸的应用，属于生物工程

技术介绍
对羟基肉桂酸(3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸，para-hydroxycinnamicacid)，是木质纤维素的主要成分。研究表明，其可以减少致癌物质亚硝胺的形成，具有抗癌的效果。目前主要通过化学合成法合成对羟基肉桂酸(CN201110337186.6，JP200423154)，污染较大。也有通过水解生物质原料获得(WO/2017/170549)。目前通过生物法合成对羟基肉桂酸是最热门的方向，如通过酪氨酸氨裂解酶转化酪氨酸生成对羟基肉桂酸的方法(US20170166936、US20080213846)、通过微生物转化肉桂酸生产对羟基肉桂酸(US20030170834)、大肠杆菌工程菌利用葡萄糖为原料合成对羟基肉桂酸(EP1589112、WO/2002/090523)。这些方法都有待于改进，以降低成本和提高产品纯度。
技术实现思路
基于目前各种方法的缺陷，本专利技术提出了一种新型的对羟基肉桂酸的生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了对羟基肉桂酸的高效生产。本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能以廉价底物高效生产对羟基肉桂酸的重组菌，同时本专利技术要解决该菌株的构建和应用的技术问题。本专利技术的第一个目的是提供能低成本生产对羟基肉桂酸的重组菌；所述重组菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶。在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶来自LactococcuslactisATCC19257。在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_003131075.1序列。在一种实施方式中，所述L-乳酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NZ_JXJZ01000017REGION:18532..19509的序列。在一种实施方式中，所述NADH氧化酶来自LactococcuslactisATCC19257。在一种实施方式中，所述NADH氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_032950924.1序列。在一种实施方式中，所述NADH氧化酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NZ_JXJZ01000002REGION:complement(39571..40911)。在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来自于ErwiniaherbicolaATCC214344。在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为P31011.2。在一种实施方式中，所述酪氨酸氨裂解酶为的来自RhodobactersphaeroidesATCCBAA-808。在一种实施方式中，酪氨酸氨裂解酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_011339422.1的序列。在一种实施方式中，酪氨酸氨裂解酶的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NC_007494REGION:complement(668571..670142)。在一种实施方式中，所述重组菌，包括将编码酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、NADH氧化酶和L-乳酸脱氢的酶的基因，连接到2个质粒上，然后将重组质粒转化宿主大肠杆菌，得到重组工程菌。在一种实施方式中，所述NADH氧化酶基因和L-乳酸脱氢酶基因是连接到质粒pACYCDue-1后表达、酪氨酸氨裂解酶和酪氨酸酚裂解酶基因是连接到质粒pETDuet-1后表达。在一种实施方式中，所述宿主菌为EscherichiacoliBL21(DE3)。在一种实施方式中，所述重组菌还敲除了酚类物质分解基因。在一种实施方式中，所述敲除的酚类物质分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述酚类物质分解基因的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NC_012892REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。在一种实施方式中，所述重组菌还强化表达了乳酸转运基因、苯酚转运基因、辅酶合成相关基因中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述强化表达是通过将EscherichiacoliBL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。在一种实施方式中，所述强化表达的基因为lldP(乳酸转运基因)、hpaX(苯酚转运基因)、mhpT(苯酚转运基因)、nadA(NAD合成基因)、pdxJ(磷酸吡多醛合成基因)中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述lldP在NCBI上accessionNO为：NC_012892REGION:3646638..3648293；hpaX为；NC_012892REGION:complement(4502025..4503401)；mhpT为NC_012892REGION:344788..345999；nadA为NC_012892REGION:740487..741530；pdxJ为NC_012892REGION:complement(2567591..2568322)。在一种实施方式中，所述重组菌是在敲除了hpaD和mhpB的大肠杆菌宿主的基础上，强化表达了lldP、hpaX、mhpT、nadA、pdxJ，并且同时表达了酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L-乳酸脱氢酶和NADH氧化酶。本专利技术的第二个目的是提供一种生产对羟基肉桂酸的方法，所述方法是利用本专利技术的重组菌。在一种实施方式中，所述生产对羟基肉桂酸，是进行全细胞转化生产。在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重为1-200g/L，苯酚浓度为1-200g/L，L-乳酸浓度为1-200g/L，pH6.0-9.0，氨根离子浓度1-30g/L；于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相色谱测定对羟基肉桂酸产量。本专利技术的第三个目的是提供本专利技术重组菌或者本专利技术方法在化工、食品、医药等领域的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术构建了一种新型的四酶共表达基因工程菌，该菌可应用于对羟基肉桂酸的生产。该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。具体实施方案本专利技术的工程菌的功能核心在于可以同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、NADH氧化酶和L-乳酸脱氢酶。其原理为：在工程菌全细胞内，L-乳酸脱氢酶以菌体内的NAD为辅酶将L-乳酸脱氢生成丙酮酸和NADH；酪氨酸酚裂解酶催化丙酮酸、氨根离子、苯酚生成L-酪氨酸；L-酪氨酸则被酪氨酸氨裂解酶脱氨生成对羟基肉桂酸；NADH氧化酶将NADH脱氢实现了辅酶NAD的再生。同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相关基因促进底物的转运及减少酚类物质的分解。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：1.本专利技术所涉及的菌株及质粒购自美国菌种保藏中心ATCC的EscherichiacoliBL21(DE3)、RhodobactersphaeroidesATCCBAA-808、LactococcuslactisATCC19257、ErwiniaherbicolaATCC214344。购本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产对羟基苯乳酸的方法，其特征在于，所述方法是利用重组大肠杆菌进行生产；其中，所述重组大肠杆菌同时表达了外源酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L‑乳酸脱氢酶、NADH氧化酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类化合物分解相关的基因。

【技术特征摘要】
1.一种生产对羟基苯乳酸的方法，其特征在于，所述方法是利用重组大肠杆菌进行生产；其中，所述重组大肠杆菌同时表达了外源酪氨酸酚裂解酶、酪氨酸氨裂解酶、L-乳酸脱氢酶、NADH氧化酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类化合物分解相关的基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酚类分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌还强化表达了乳酸转运基因、苯酚转运基因、NAD合成基因、磷酸吡多醛合成基因一种或者多种。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述强化表达的基因为lldP、hpaX、mhpT、nadA、pdxJ中的任意一种或多种。5.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述强化表达是通过将宿主大肠杆菌基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酪...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇杰，熊天真，蒋静，丁彦蕊，白亚军，郑晓晖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32