一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用技术

本发明专利技术提供了一种以丙二酸盐为原料合成3‑羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用，本发明专利技术旨在大肠杆菌中表达外源的matB基因、mcrC基因和mcrN基因，同时选择多种外源基因matC在大肠杆菌中外源表达且对其进行优化，从而建立一条新的生物合成3‑羟基丙酸的方法，最终获得含有丙二酰辅酶A合成酶、C端丙二酰辅酶A还原酶和N端丙二酰辅酶A还原酶对应的编码基因的重组细胞。该重组细胞能够从丙二酸盐合成3‑羟基丙酸，从而在大肠杆菌中建立一条新的利用丙二酸盐为原料的生物催化剂生产平台化合物3‑羟基丙酸的方法。同时，通过载体构建提高代谢过程所需的还原力NADPH的NAD激酶和转氢酶，进而提高产物3‑羟基丙酸的产量。

【技术实现步骤摘要】
一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用。
技术介绍
3-羟基丙酸是一种重要的化工平台化合物，通过氧化、脱水、酯化反应等可以合成多种重要的化学物质，如丙烯酸、丙二酸，以及生物降解性塑料聚3-羟基丙酸，还可以作为食品或饲料的添加剂和防腐剂。目前，3-羟基丙酸的合成方法主要有化学法和微生物法，化学合成方法：将3-羟基丙腈加入氢氧化钠溶液中在30℃反应，反应混合物减压蒸发至干，继续升高温度直至产物变为糊状。冷却，加硫酸搅拌，用乙醚提取生成的3-羟基丙酸，蒸除乙醚，得含量75-80％的糖浆状3-羟基丙酸，收率28-31％。化学法使用不可再生资源，副产物多、分离困难、容易造成环境污染，近年来的研究热点逐渐聚焦到微生物方法上。微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供了一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用，本专利技术是将丙二酰-CoA合成酶matB以及丙二酰辅酶A还原酶mcr通过基因工程手段在大肠杆菌中表达，同时通过比较三种来源的丙二酸盐转运酶matC从而进行了优化，且通过载体构建提高代谢过程所需的还原力NADPH的NAD激酶(YfjB)和转氢酶(PntAB)，从而建立一条新的利用丙二酸盐为原料的生物催化剂生产三羟基丙酸的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法，它包括以下步骤：(1)分别克隆matB基因、mcrN基因、mcrC基因、YfjB基因、PntAB基因和matC基因；(2)扩增基因matB片段，将该片段与载体pACYCDuet分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切后的载体与matB基因片段按摩尔比1:3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB；扩增基因mcrC片段，将pET28a载体与基因mcrC片段分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切后的载体与mcrC基因片段按摩尔比1:3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28a-mcrC；扩增基因mcrN片段，将载体pACYCDuet-matB与基因mcrN片段分别用NdeI进行单酶切，酶切后的载体与mcrN基因片段做无缝连接，融合产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN；将matC基因连于质粒pACYCDuet-matB-mcrN的BglII的酶切位点处，获得重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC；扩增YfjB基因片段，将上述的重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC与该YfjB基因片段分别用HindIII进行单切，酶切后的载体与YfjB基因片段做无缝连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC-YfjB；扩增PntAB基因片段，将上述的重组质粒pET28a-mcrC与该片段分别用NotI进行单切，酶切后的载体与PntAB基因片段做无缝连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28a-mcrC-PntAB；(3)将重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN和pET28a-mcrC、重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC-YfjB和重组质粒pET28a-mcrC-PntAB，共同转化大肠杆菌，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，分别获得阳性克隆工程大肠杆菌；(4)活化后的上述工程大肠杆菌接种到含有卡那霉素、氯霉素以葡萄糖为碳源的培养液中培养，然后转入在以丙二酸盐为碳源的培养基中继续诱导培养，发酵获得3-羟基丙酸。进一步的：所述matB基因来源于：拟南芥、沼泽红假单胞菌、氧化木糖无色杆菌、泥炭假单胞菌或支气管败血性博代氏杆菌。进一步的：所述matC基因来源于：裂殖酵母、根瘤菌、古菌、藤黄单胞菌或长柄镰刀菌。进一步的：所述mcr基因来源于：海洋卤虫、亚硝基假丝酵母、绿曲桡菌或嗜盐小碱菌。进一步的：所述YfjB基因是来源于：蚜虫、大肠杆菌K-12、沙门氏菌或欧文氏菌。进一步的：所述PntAB基因是来源于：柔嫩艾美球虫、放线菌、大肠杆菌、嗜热栖热菌或牛型结核菌。进一步的：所述步骤(4)中发酵是将活化后的所述工程大肠杆菌接种到M9液体培养液中培养，当OD600nm为0.6时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mmol·L-1，然后转入在以丙二酸盐为碳源的M9液体培养基中继续诱导培养，最终发酵获得3-羟基丙酸。本专利技术还提供了所述合成3-羟基丙酸的制备方法中获得的重组细胞，所述重组细胞为包含matB基因、mcrN基因和matC基因的pACYCDuet载体以及包含mcrC基因的pET28a载体。本专利技术还提供了所述的重组细胞在用于以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益技术效果：(1)本专利技术步骤只有三步酶催化，更有利于代谢途径后续调控及转化效率的提高；(2)后两步骤所用的mcrN基因与mcrC基因是已经优化后的序列，转化率较高；(3)丙二酸盐转运所需要的matC基因碱基进行了优化，且通过比较了三种来源的基因后选出了最优的matC；(4)本专利技术中在大肠杆菌中过表达了NAD激酶以及转氢酶，可以为催化反应中提供较多的还原力。本专利技术主要通过基因工程的手段，在细胞中表达丙二酰辅酶A合成酶B、二羧酸盐载体蛋白、C端丙二酰辅酶A还原酶(mcrC)和N端丙二酰辅酶A还原酶(mcrN)，获得的重组细胞含有表达上述酶的基因，该重组细胞能够从丙二酸盐合成3-羟基丙酸，同时在大肠杆菌中过表达NAD激酶以及转氢酶，提供大量的还原力，最终在大肠杆菌细胞中成功建立一种高效的三羟基丙酸生物合成代谢途径，获得了可以高效合成三羟基丙酸的重组细胞，从而建立一条新的利用丙二酸盐为原料的生物催化剂生产三羟基丙酸的生物法法。附图说明图1是本专利技术中新合成三羟基丙酸途径的示意图。图2是本专利技术中pSGN-3的质粒图谱。图3是本专利技术中pSGN-4的质粒图谱。图4是本专利技术中pYQ-1的质粒图谱。图5是本专利技术中pYQ-2的质粒图谱。图6是本专利技术中HPLC测定3-HP的图谱。具体实施方式下面参照具体的实施例进一步描述本专利技术，但是本领域技术人员应该理解，本专利技术并不限于下述的具体实施例。实施例1如图1所示，本专利技术通过在大肠杆菌中共同表达来源于沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的丙二酰辅酶A合成酶B(MatB)；来源于根瘤菌(Rhizobiumleguminosarumbv.trifolii)二羧酸盐载体蛋白(MatC)和来源于绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)的C端丙二酰辅酶A还原酶(mcrC)和N端丙二酰辅酶A还原酶(mcrN)，利用丙二酸盐生物合成3-羟基丙酸。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以丙二酸盐为原料合成3‑羟基丙酸的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：（1） 分别克隆matB基因、mcrN基因、mcrC基因、YfjB基因、PntAB基因和matC基因；（2）扩增基因matB片段，将该片段与载体pACYCDuet分别用BamHI和Hind III进行双酶切，酶切后的载体与mat B基因片段按摩尔比1:3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet‑matB；扩增基因mcrC片段，将pET28a载体与基因mcrC片段分别用BamHI 和 HindIII进行双酶切，酶切后的载体与mcrC基因片段按摩尔比1:3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28a‑mcrC；扩增基因mcrN片段，将载体pACYCDuet‑matB与基因mcrN片段分别用Nde I进行单酶切，酶切后的载体与mcrN基因片段做无缝连接，融合产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet‑matB‑mcrN；将matC基因连于质粒pACYCDuet‑matB‑mcrN的BglII的酶切位点处，获得重组质粒pACYCDuet‑matB‑mcrN‑matC；扩增YfjB基因片段，将上述的重组质粒pACYCDuet‑matB‑mcrN‑matC与该YfjB基因片段分别用Hind III进行单切，酶切后的载体与YfjB基因片段做无缝连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet‑matB‑mcrN‑matC‑YfjB；扩增PntAB基因片段，将上述的重组质粒pET28a‑mcrC与该片段分别用NotI进行单切，酶切后的载体与PntAB基因片段做无缝连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28a‑mcrC‑PntAB；（3）将重组质粒pACYCDuet‑matB‑mcrN和pET28a‑mcrC、重组质粒pACYCDuet‑matB‑mcrN‑matC‑YfjB和重组质粒pET28a‑mcrC‑PntAB，共同转化大肠杆菌，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，分别获得阳性克隆工程大肠杆菌；（4）活化后的上述工程大肠杆菌接种到含有卡那霉素、氯霉素以葡萄糖为碳源的培养液中培养，然后转入在以丙二酸盐为碳源的培养基中继续诱导培养，发酵获得3‑羟基丙酸。...

【技术特征摘要】
1.一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）分别克隆matB基因、mcrN基因、mcrC基因、YfjB基因、PntAB基因和matC基因；（2）扩增基因matB片段，将该片段与载体pACYCDuet分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切后的载体与matB基因片段按摩尔比1:3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB；扩增基因mcrC片段，将pET28a载体与基因mcrC片段分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切后的载体与mcrC基因片段按摩尔比1:3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28a-mcrC；扩增基因mcrN片段，将载体pACYCDuet-matB与基因mcrN片段分别用NdeI进行单酶切，酶切后的载体与mcrN基因片段做无缝连接，融合产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN；将matC基因连于质粒pACYCDuet-matB-mcrN的BglII的酶切位点处，获得重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC；扩增YfjB基因片段，将上述的重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC与该YfjB基因片段分别用HindIII进行单切，酶切后的载体与YfjB基因片段做无缝连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC-YfjB；扩增PntAB基因片段，将上述的重组质粒pET28a-mcrC与该片段分别用NotI进行单切，酶切后的载体与PntAB基因片段做无缝连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28a-mcrC-PntAB；（3）将重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN和pET28a-mcrC、重组质粒pACYCDuet-ma...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨建明，孙冠男，梁波，王兆宝，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37