一种枯草芽孢杆菌及其应用、一种酶制剂制造技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌，名称为枯草芽孢杆菌HU 528，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2018年4月23日，保藏编号为GDMCC NO：60364。本发明专利技术还公开了一种酶制剂，采用所述的枯草芽孢杆菌制备而成。本发明专利技术同时公开了上述枯草芽孢杆菌用于制备具有降血压活性的酵母酶解产物。采用本发明专利技术的枯草芽孢杆菌HU 528发酵制备的酶制剂具有蛋白酶和β‑葡聚糖酶活性，可用于破坏酵母细胞壁和水解酵母蛋白。本发明专利技术获得的酵母酶解产物具有较好的生物活性，经体内外活性测定，该酶解物组分至少具有降血压、抗氧化的活性，可作为高血压患者非药物治疗的食品，可用于有效预防、控制、缓解、辅助治疗高血压。

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌及其应用、一种酶制剂
本专利技术涉及食品生物
，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用和一种酶制剂。
技术介绍
非药物治疗是治疗和控制高血压的重要手段，以酵母为原料开发的降血压多肽产品有望成为高血压非药物治疗的安全、绿色功能性食品。采用市售的酵母抽提复合酶水解酵母粉，去除糖类和核酸物质后得到的多肽具有ACE抑制活性；进一步应用超滤膜分离和柱层析后获得了具有降血压活性较高的六肽。国外学者Mirzaei采用超声破壁辅助胰蛋白酶水解酵母制备了ACE抑制肽。由于酵母细胞壁较厚，需要对酵母破壁以释放胞内蛋白质，采用单一蛋白酶水解酵母时，必须采用其它方法(如超声破壁)提取酵母蛋白。酵母抽提复合酶是用于生产酵母抽提物的混合酶，除了含有蛋白酶外，还含有能水解酵母细胞壁的β-葡聚糖酶和将蛋白质或多肽水解成氨基酸的外肽酶，虽然能同时进行酵母破壁和蛋白质水解，但是，外肽酶会将具有活性的多肽进一步水解成氨基酸。此外，不同蛋白酶作用于蛋白质的水解位点不同，水解酵母获得的多肽组成、大小和活性均不同。目前，还未有专用于水解酵母制备降血压活性多肽的酶制剂。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌。本专利技术的另一目的在于提供一种酶制剂。本专利技术的再一目的在于提供上述枯草芽孢杆菌的应用，用上述枯草芽孢杆菌发酵生产的酶制剂水解食用酵母干粉，制备具有降血压活性的酵母酶解产物。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种枯草芽孢杆菌，名称为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU528，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2018年4月23日，保藏编号为GDMCCNO：60364，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。一种酶制剂，采用所述的枯草芽孢杆菌制备而成。所述的酶制剂，其制备过程为：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU528斜面菌种接种于LB培养基，接种于已灭菌的液体培养基，在温度为25～45℃，搅拌转速为150～250r/min的条件下发酵培养30～60h后，发酵上清液即为酶制剂。所述酶制剂的蛋白酶活性为800U/mL～3000U/mL，β-葡聚糖酶活性为0.5U/mL～3U/mL。所述的枯草芽孢杆菌的应用，用于制备具有降血压活性的酵母酶解产物。所述制备具有降血压活性的酵母酶解产物，包括制备所述酶制剂步骤和应用所述的酶制剂水解食用酵母粉两个步骤。所述的液体培养基的配制方法为：在蒸馏水中加入胰蛋白胨0.5～2％w/w、葡萄糖0.1～1％w/w、CaCl20～0.3％w/w、NaCl0.1～0.3％w/w，混合均匀后，调节液体培养基pH为5.0～9.0。所述酶水解食用酵母粉步骤具体为：将所述酶制剂与食用酵母干粉混合，得到混合液；调节pH为5.0～9.0，在40～70℃酶解2～10h，95-105℃下灭酶5-15min，离心，将上清液进行喷雾干燥，得到酵母酶解产物。所述混合液的配制方法为：在食用酵母粉中按每克酵母粉添加含蛋白酶活性2000～15000U的酶制剂，补充无菌水至食用酵母粉与混合液的料液体积比，为1:5～1:25。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：(1)采用本专利技术的枯草芽孢杆菌HU528发酵制备的酶制剂具有蛋白酶和β-葡聚糖酶活性，可用于破坏酵母细胞壁和水解酵母蛋白。以酪蛋白为底物，所述酶制剂的蛋白酶活性为800U/mL～3000U/mL；以酵母β-葡聚糖为底物，所述酶制剂的β-葡聚糖酶活性为0.5U/mL～3U/mL。(2)本专利技术以普通培养基发酵枯草芽孢杆菌胞外生产的酶制剂，不需要经过其它的分离、浓缩、富集或者固定化工艺便可以用于酶解食用酵母粉，酶解工艺过程简单，生产质量稳定，实现了发酵制备酶制剂与酶水解食用酵母粉相互集成。(3)本专利技术的酶制剂中含有的β-葡聚糖酶可破坏酵母细胞壁，释放酵母胞内蛋白，所含的蛋白酶则可以水解酵母蛋白，使用一种酶制剂便实现了酵母蛋白提取和水解有机耦合，提高了生物活性酶解产物的生产效率，缩短了工艺流程。(4)本专利技术获得的酵母酶解产物具有较好的生物活性，经体内外活性测定，该酶解物组分至少具有降血压、抗氧化的活性，可作为高血压患者非药物治疗的食品，可用于有效预防、控制、缓解、辅助治疗高血压。附图说明图1为菌株HU528的菌落图。图2为菌株HU528的显微照片。图3为菌株HU528的16SrDNA基因序列。图4为菌株HU528的16SrDNA基因进化树。图5为菌株HU528发酵生产的酶制剂分离纯化各步骤收集组分的SDS-PAGE图谱。图6为一次灌胃给食(药)酵母酶解产物等对大鼠收缩压的影响(注：n＝8，同一时间点，各剂量组与空白对照组相比，*，p<0.05差异显著，**，p<0.01差异显著)。图7为长期灌胃给食(药)酵母酶解产物等对大鼠收缩压的影响(注：n＝8，同一时间点，各剂量组与空白对照组相比，*，p<0.05差异显著，**，p<0.01差异显著)。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术作进一步地详细说明，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例11、菌株HU528的获得与鉴定从传统的西藏酥油作坊采集土壤，在10g富含蛋白质的土壤样品中加入100mL无菌水中，28℃下振荡30min制取菌悬液，取菌悬液采用稀释涂布平板法于28℃下在固体培养基(0.4％(w/w，下同)牛肉浸膏，0.6％胰蛋白胨，0.2％酵母提取物，0.5％NaCl，2％琼脂，调节pH7.0)上培养1-2d。将平板上获得的不同生长性状的单菌落接种至LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，调节pH7.0)培养48h，测定发酵液中蛋白酶活性，获得产蛋白酶菌株，命名为菌株HU528。将HU528菌株于37℃下在固体平板培养基划线培养24h后，菌落呈白色圆形，表面粗糙褶皱，边缘不整齐(图1)。显微镜观察发现该菌株呈杆状，椭圆形，如图2所示。根据菌落形态初步判定该菌株属于芽孢杆菌属。为了进一步确定菌株HU528的物种属性，采用PCR扩增HU528的16SrDNA，扩增引物采用细菌通用引物：上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。并测定16SrDNA的碱基序列，部分保守序列如图3所示。用BLAST程序将图3所示序列与NCBI中已公布细菌的16SrDNA序列进行比对，发现该菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)序列一致性达99％以上。利用Mega分析软件对菌株HU528进行同源序列比对并绘制进化树，结果如图4所示(菌株编号为各菌株16SrDNA序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中的注册号)。由图4所见，菌株HU528与BacillussubtilisstrainSCUT09(FN869038.1)位于并列分支，参照刘波的《芽孢杆菌生物学》，结合HU528的形态特点，进一步确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，并命名为枯草芽孢杆菌HU528。2、菌株HU528的发酵培养将HU528保存于斜面培养基中，4℃保存于冰箱中，上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HU 528，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2018年4月23日，保藏编号为GDMCC NO：60364。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，名称为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU528，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2018年4月23日，保藏编号为GDMCCNO：60364。2.一种酶制剂，其特征在于，采用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制备而成。3.根据权利要求2所述的酶制剂，其特征在于，其制备过程为：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HU528斜面菌种接种于LB培养基，接种于已灭菌的液体培养基，在温度为25～45℃，搅拌转速为150～250r/min的条件下发酵培养30～60h后，发酵上清液即为酶制剂。4.根据权利要求2所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂的蛋白酶活性为800U/mL～3000U/mL，β-葡聚糖酶活性为0.5U/mL～3U/mL。5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，用于制备具有降血压活性的酵母酶解产物。6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述制备具有降血压活性的酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡松青，王佳佳，侯轶，
申请(专利权)人：华南理工大学，中新国际联合研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44