一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开一种产β‑紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术以解脂耶氏酵母为底盘细胞，将β‑紫罗兰酮表达模块(约14.5kb)线性化后转入解脂耶氏酵母体内并利用CRISPR/cas9技术介导整合到设计的染色体位置，具有简单快速高效的优点，2～3周即可获得大片段整合工程菌株，明显缩短工程菌构建周期。按照本发明专利技术的方法获得的基因工程菌的β‑紫罗兰酮的摇瓶发酵初产量可达到约6.3mg/L。本发明专利技术可利用简单培养基发酵生产香料β‑紫罗兰酮，可实现多基因一次性高效转化与整合，可明显缩短工程菌构建时间，所得工程菌可利用葡萄糖、甘油等简单碳源进行香料β‑紫罗兰酮的发酵生产，具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术属于微生物发酵领域，具体地说，是关于一种产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
紫罗兰酮是一种高级香料，是调香中不可或缺的重要的原香料，用途广，需求量大。紫罗兰酮的分子式为C13H20O，根据双键位置的不同，可将紫罗兰酮划分为α体，β体和γ体3种同分异构体，而自然界中多以α体，β体这两种异构的混合形式存在，其中β-紫罗兰酮是用于高档级精细日用化妆品的调香剂和增香剂，也是医药工业上合成维生素A的重要原料。在食品行业中，紫罗兰酮常用作高档食品、饮料的增香剂，是中国GB2760-2011规定允许使用的食用香料，主要用以配制龙眼、树莓、黑莓、樱桃、柑橘等香精，全球年需求量达近万吨。由于国内目前的生产工艺限制，缺口超过1000吨，特别是医药级的，基本全靠进口。产品的市场潜力大，也急需高效的生产方法。目前生产β-紫罗兰酮的方法主要有化学合成。化学合成法是以柠檬醛和丙酮为原料，经缩合、环化、分离提纯得到的。国外由于原材料的缺乏，主要侧重利用石油化工产品为原料进行合成。而我国的山苍子油年产量已达2000吨，而从山苍子油中可直接提取获得柠檬醛，故我国主要改用该方法进行β-紫罗兰酮的工业合成。但该方法具有总回收率低(仅为40％～45％)、工艺较为复杂、合成周期较长等缺点。相对来讲，生物发酵法生产β-紫罗兰酮在一定程度上克服了化学合成法的缺点，具有生产工艺简单、成本低、产品质量好等优点。β-紫罗兰酮生物体内合成是以β-类胡萝卜素为前体，在类胡萝卜素裂解双加氧酶的催化下合成的。目前发现许多微生物都具有生产类胡萝卜素的能力，而且由解脂耶氏酵母出发构建的工程菌株已经实现了β-类胡萝卜素的高产[CN201210525553.X，CN201410243227.9]。然而，关于β-紫罗兰酮生物异源合成的报道非常少。Lopez等人通过在酿酒酵母中引入红法夫酵母的β-胡萝卜素合成途径和来源于矮牵牛的类胡萝卜素裂解双加氧酶，最终获得了5mg/LDCW[LópezJ,etal.Productionofbeta-iononebycombinedexpressionofcarotenogenicandplantCCD1genesinSaccharomycescerevisiae.MicrobialCellFactories.2015.14:84]。由于代谢调控机理及宿主本身的限制，β-紫罗兰酮的产量还有望进一步得到提高。解脂耶氏酵母是一种一般安全(Generallyrecognizedassafe，GRAS)的微生物，主要分布在富含脂肪和蛋白质的环境中，因其在脂类和萜类合成上的优势而引起越来越多的研究兴趣。目前，由解脂耶氏酵母工程菌生产的DHA和EPA两种功能性脂类产品已在杜邦公司实现了商业化生产[WO2012027689]。还有更多的产品正走向工业生产规模的水平，如萜类化合物胡萝卜素的产量已经达4.5g/L的水平[CN201410243227.9]，而且帝斯曼公司也开始利用解脂耶氏酵母进行冷杉醇的合成[WO2016094178]。证明了解脂耶氏酵母在异源表达萜类化合物上有一定的优势，有望开发用于多种萜类香料的合成。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法。本专利技术的另一目的在于提供通过上述构建方法获得的产β-紫罗兰酮基因工程菌。本专利技术的再一目的在于提供上述产β-紫罗兰酮基因工程菌的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供的一种产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：1)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子和所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子；2)构建CRISPR/cas9操作载体，包括导向染色体整合位点的sgRNA转录模块、cas9蛋白表达模块和筛选标记；3)将步骤1)所述基因表达模块和步骤2)所述CRISPR/cas9操作载体共转化至解脂耶氏酵母中，获得产β-紫罗兰酮基因工程菌。根据本专利技术，步骤1)中所述的基因表达模块还包括rDNA基因整合上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒。根据本专利技术，步骤1)中所述的构建基因表达模块包括以下步骤：1.1通过PCR扩增获得所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段，所述rDNA基因整合上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；1.2将所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段、所述rDNA基因整合上下游同源臂、所述筛选标记基因表达盒和筛选标记丢失模块片段分别通过gibsonassembly组装法进行组装获得基因表达模块。根据本专利技术的优选实施例，步骤1)中所述β-紫罗兰酮生产相关的基因为CarB，CarRP，CCD1。根据本专利技术的优选实施例，所述CarB和CarRP来源于卷枝毛霉菌，CCD1来源于矮牵牛。根据本专利技术的优选实施例，步骤1)中所述启动子选自TEF1p，EXP1p，GPD2p。根据本专利技术的优选实施例，所述启动子来源于解脂耶氏酵母。根据本专利技术的优选实施例，步骤1)所述终止子选自XPR2t，LIP2t，MIG1t。根据本专利技术的优选实施例，所述终止子来源于解脂耶氏酵母。根据本专利技术的优选实施例，所述筛选标记基因为Ura3。根据本专利技术的优选实施例，所述筛选标记基因来源于解脂耶氏酵母。根据本专利技术的优选实施例，所述筛选标记丢失模块为hisG-hisG。根据本专利技术的优选实施例，所述筛选标记丢失模块来源为pNKY51质粒(ADDGENE编号：14839)。根据本专利技术，步骤2)中所述的构建CRISPR/cas9操作载体包括以下步骤：通过在线设计染色体整合位点的sgRNA靶序列，将sgRNA靶序列引入到引物中，通过PCR的方法，将sgRNA靶序列引入到CRISPR/cas9操作载体上。根据本专利技术的优选实施例，步骤2)中所述载体以pCAS1yl为出发载体。根据本专利技术的优选实施例，所述sgRNA靶序列设计网站为：http://e-crisp-test.dkfz.de/E-CRISP/designcrispr.html。根据本专利技术的优选实施例，所述染色体整合位点可以为染色体上的非必需基因位点，优选rDNA位点。优选的，所述的sgRNA靶序列为GGAGTAACTATGCTCTCTTAAGG，SEQIDNO：2。其中，下划线部分为PAM位点。所述的sgRNA序列如SEQIDNO：1。一种产β-紫罗兰酮基因工程菌，通过上述构建方法构建得到。所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌在发酵生产β-紫罗兰酮中的应用，尤其可应用于利用多种碳源为底物发酵生产β-紫罗兰酮。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术以解脂耶氏酵母为底盘细胞，将β-紫罗兰酮表达模块(约14.5kb)线性化后转入解脂耶氏酵母体内并利用CRISPR/cas9技术介导整合到设计的染色体位置，具有简单快速高效的优点，2～3周即可获得大片段整合工程菌株，明显缩短本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产β‑紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括β‑紫罗兰酮生产相关的基因、所述β‑紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子和所述β‑紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子；2)构建CRISPR/cas9操作载体，包括导向染色体整合位点的sgRNA转录模块、cas9蛋白表达模块和筛选标记；3)将步骤1)所述基因表达模块和步骤2)所述CRISPR/cas9操作载体共转化至解脂耶氏酵母中，获得产β‑紫罗兰酮基因工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子和所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子；2)构建CRISPR/cas9操作载体，包括导向染色体整合位点的sgRNA转录模块、cas9蛋白表达模块和筛选标记；3)将步骤1)所述基因表达模块和步骤2)所述CRISPR/cas9操作载体共转化至解脂耶氏酵母中，获得产β-紫罗兰酮基因工程菌。2.根据权利要求1所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤1)中所述的基因表达模块还包括rDNA基因整合上下游同源臂、可丢失的筛选标记基因表达盒。3.根据权利要求2所述的产β-紫罗兰酮基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤1)中所述的构建基因表达模块包括以下步骤：1.1通过PCR扩增获得所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段，所述rDNA基因整合上下游同源臂、所述可丢失的筛选标记基因表达盒；1.2将所述β-紫罗兰酮生产相关的基因、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因上游的启动子片段、所述β-紫罗兰酮生产相关的基因下游的终止子片段、所述rDNA基因整合上下游同源臂、所述筛选标记基因表达盒和筛选标记丢失模块片段分别通过gibsonassembly组装法进行组...

【专利技术属性】
技术研发人员：林章凛，王婷婷，杨晓锋，卢彦坪，张兴，杨晴玉，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44