基因元件及其在酿酒酵母染色体数目、拷贝数、结构变异中的应用制造技术

本发明专利技术涉及合成生物学领域，特别涉及酿酒酵母染色体数目变异的产生方法。本发明专利技术利用酿酒酵母基因组重排的特性，通过诱导酿酒酵母环形染色体的基因组重排，获得染色体数目变异的非整倍体酿酒酵母菌株、实现酿酒酵母环形染色体拷贝数连续变异、获得染色体结构变异酿酒酵母菌株、获得表型连续进化酿酒酵母菌株，并揭示结构变异与表型增强的关联。本发明专利技术利用染色体重排的方法实现酿酒酵母染色体数目、拷贝数和结构变异、揭示结构变异，为非整倍体酿酒酵母菌株获得和染色体结构变异与功能关系研究提供了一种全新的研究手段。

【技术实现步骤摘要】
基因元件及其在酿酒酵母染色体数目、拷贝数、结构变异中的应用
本专利技术涉及合成生物学领域，特别涉及基因元件及其在酿酒酵母染色体数目、拷贝数、结构变异中的应用。
技术介绍
真核生物细胞核内整条染色体或染色体片段的增加与丢失会导致染色体数目变异，产生非整倍体细胞，导致生物遗传物质的改变。非整倍体与癌症等疾病和发育障碍有关。酿酒酵母中的存在大量与人类基因具有同源性的基因，因此广泛用于人类疾病的研究当中。酵母是进行非整倍体分子遗传研究的重要模式生物。随着选择性产生非整倍体酵母菌株而不引起其他遗传变化的方法、检测非整倍性的技术、以及尖端的遗传学和组学方法发展，非整倍性的理解已经显着提高。酵母作为一种简单有效的模型，用于研究非整倍体领域的复杂问题。染色体分离和复制错误是产生非整倍体细胞的原因。酿酒酵母细胞分裂过程中约有0.33x10-9的频率自发发生染色体数目的增加或减少。实验室条件下，二倍体出芽酵母酿酒酵母中染色体V的自发损失率约为每106个细胞出现2-8个。与点突变等其他类型突变相比，非整倍性作用于16条染色体非常狭窄的基因组空间内，发生特定非整倍性的机会更高。有丝分裂过程中纺锤体组装的正常功能和重复染色体的正确结构对于染色体的正确分离至关重要。此外，纺锤体组装检查点可作为防止有丝分裂过程中染色体错误分离的监测机制。上述过程中的任何缺陷都可能影响染色体分离的准确性，从而产生非整倍体后代。通过对出芽酵母进行遗传筛选，发现其基因组中至少10％的序列涉及维持染色体稳定性的功能。这些基因被称为CIN基因，它们在动粒和纺锤体微管相互作用、DNA复制、修复、凝聚和纺锤体装配检查点过程中起作用，其突变将导致染色体的不稳定性(CIN)。CIN基因的突变不一定会引起CIN，但是某些非整倍体核型有助于减轻由基因突变引起的生长缺陷。例如，从rnr1Δ菌株中分离出的大菌落中检测到额外的IX号染色体拷贝，这可能是通过增加IX号染色体上旁系同源基因RNR3的剂量来改善生长的结果，但是，RNR1的缺失不一定会导致CIN。环境压力可能会诱导酵母染色体出现分离错误。白假丝酵母菌暴露于热应激和抗真菌药物环境下会增加染色体丢失的频率。同样，高剂量的氟康唑会引起新生隐球菌的染色体不稳定，高频出现菌株的非整倍性(0.3—0.6％)。最近一项研究通过监测微染色体的缺失来研究不同压力条件对出芽酵母中CIN的影响，发现许多压力条件对CIN有促进作用。具体而言，与无应激培养条件相比，利用各种手段抑制Hsp90分子伴侣显著增加了微染色体的丢失率。这种作用与Hsp90在动粒组装中的关键作用有关。多倍体化是产生酵母非整倍体的另一重要途径。三倍体或五倍体细胞减数分裂过程中几乎一定会产生非整倍体后代。多倍体细胞有丝分裂出错率更高，四倍体酿酒酵母的染色体丢失率高于二倍体菌株，这是由于四倍体中纺锤体的几何结构改变引起了单极动粒附着的增加。四倍体白假丝酵母在酿酒酵母“预生孢”培养基和山梨糖培养基中培养时，会出现明显的染色体损失现象，产生二倍体或近二倍体的非整倍体后代细胞。天然基因组重排和变异时间跨度较大，功能定向进化可控性低。通过人工设计实现基因组不同尺度重排和变异可以极大弥补天然基因重排的不足，加速新功能的发现。化学合成基因组提供了一种“自下而上、用创造去理解”的新思路，是用于生命信息理解、功能发现的崭新强大工具。利用类似机制，在化学合成的酵母染色体内预设了“基于LoxPsym位点特异性重组的合成型基因组重排系统(SCRaMbLE)”，该设计初步实现了单基因区段缺失、复制、易位的基因组重排方法。目前，利用该系统在二倍体合成型酿酒酵母中进行基因组重排，已经实现了β-胡萝卜素产量的多轮提升，但由于存在单倍体基因组重排致死率高的缺陷，尚未在单倍体合成型酿酒酵母中实现次级代谢产物的多轮产量提升。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种基因元件及其在酿酒酵母染色体数目、拷贝数、结构变异中的应用。本专利技术通过进一步优化SCRaMbLE系统在单倍体酵母中的重排尺度和效果，能够深入揭示单倍体酵母基因组多轮重排规律，探索表型与基因型间的关系，实现单倍体酵母细胞基因组DNA序列的多轮持续进化。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种基因元件，整合有vioA、vioB和vioE的CAN1基因座和编码Cre重组酶的基因。1)人工合成酵母基因组的重排原理：酿酒酵母合成基因组计划(Sc2.0)是首个真核生物基因组合成项目。相比于之前的噬菌体基因组合成以及细菌基因组合成项目，基因组的改造修饰程度更大，其中一项重要的设计原则是在每个非必须基因的3’端非翻译区(UTR)插入一个loxPsym位点。染色体上的必须基因与非必须基因通常情况下是随即分布的，这样一条合成型染色体将被众多loxPsym位点间隔划分为不同的重组单元，loxPsym位点是34bp完全对称的回文序列。在Cre重组酶的作用下，任意两个loxPsym位点都可能发生相互作用，导致两个位点之间的区域会随机发生染色体片段的缺失和倒位，同时在重组作用下处于复制状态的细胞会随机发生染色体片段的重复。由于合成型染色体具有上述特性，本研究开发了合成基因组重排技术(SCRaMbLE)。通过在合成型酵母中表达Cre重组酶，使得整个染色体上的重组单元随机发生重复，缺失，倒位，易位(Duplication，Deletion，Inversion，Translocation)。在细胞中因染色体结构的重排导致全细胞基因组水平、转录组水平以及代谢组水平均发生改变，产生多样性的表型，进而大大加速细胞的进化速度。通过建立适当的表型筛选目标和方法技术，可以快速筛选出接近目标性状的菌株，并通过二代测序技术(深度测序)和三代测序技术(长片段测序)快速分析并挖掘新靶点。2)Cre重组酶的控制：在2011年合成synIXR染色体以及和2014年合成synIII染色体这两篇工作中，研究者均使用pSCW11-Cre-EBD质粒(pCRE1)来进行化学合成基因组的重排工作。pSCW11启动子是子代细胞(Daughtercell)特异性启动子，即在酵母出芽生殖过程中，pSCW11启动子仅在子代细胞中表达。Cre-EBD是Cre重组酶和雌激素结合结构域(EBD)的融合蛋白。理论上，Cre-EBD在缺失雌二醇(Estradiol)的环境中通过与细胞质中的Hsp90蛋白结合而停留在细胞质中。当培养环境中加入雌二醇后，其与EBD结构域结合产生活化的Cre-EBD复合物从Hsp90蛋白上解离下来，并在Cre自身信号肽的引导下进入细胞核，作用于loxp位点，进而产生化学合成基因组的重排。然而在这两篇报道中，研究者们均发现即使在不加入雌二醇的培养基中培养合成型酵母，也会有少量的菌株发生SCRaMbLE，与此同时细胞生长曲线略低于对照组(不含pSCW11-Cre-EBD)，表明细胞生长受到轻微影响。尽管loxPsym位点仅插入非必须基因3’端UTR区域，但通常情况下在合成型染色体上必须基因与非必须基因均匀分散在整个基因组中，使得重排过程中同样会发生必须基因的删除，从而导致细胞死亡，生长速率下降。因此可通过对比细胞生长速率间接证明重排反应的发生。综上所述，不难发现pSCW11-Cre-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因元件，其特征在于，整合有vioA、vioB和vioE的CAN1基因座和编码Cre重组酶的基因。

【技术特征摘要】
1.一种基因元件，其特征在于，整合有vioA、vioB和vioE的CAN1基因座和编码Cre重组酶的基因。2.如权利要求1所述的基因元件，其特征在于，具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：I、具有编码Cre重组酶、VioA、VioB、VioE的核苷酸序列和CAN1的核苷酸序列；II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列；IV、与I所述序列具有相同功能性片段或功能性变体的核苷酸序列；V、如I、II、III或IV所示核苷酸序列的互补序列。3.如权利要求1或2所述的基因元件在诱导酿酒酵母基因组重排中的应用。4.如权利要求1或2所述的基因元件在酿酒酵母染色体数目连续变异、酿酒酵母染色体DNA拷贝数连续变异、酿酒酵母染色体结构连续变异、酿酒酵母的表型连续进化或酿酒酵母染色体结构变异带来的功能改变中的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，谢泽雄，王娟，李炳志，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12