The invention belongs to the field of microbial technology, and discloses a method for screening microorganisms with high protein secretion capacity, including the following steps: S1, preparation of polyclonal antibody serum; S2, selection of solid culture medium, and high temperature sterilization of solid culture medium; and solidification of solid culture medium when the temperature of solid culture medium is lowered to 50 ~60. Polyclonal antibodies were added to the body culture medium, stirred evenly, then dumped into the solid culture dish for use; S3, diluted the undetermined microorganisms, then coated on the solid culture dish for isolation and culture of monoclonal colonies; S4, observed the neutralization of proteins secreted during the growth of monoclonal colonies and polyclonal antibody serum. The size of sedimentation zone formed by reaction; S5. According to the diameter ratio of sedimentation zone to colony, microorganisms with high protein secretion ability were analyzed and screened. The application method can not only quickly screen microorganisms with high protein secretion ability, but also has universality.
【技术实现步骤摘要】
一种筛选具有高蛋白质分泌能力的微生物的方法
本专利技术属于微生物
,特别涉及一种筛选具有高蛋白质分泌能力的微生物的方法。
技术介绍
微生物普遍具备向细胞外分泌蛋白质的能力,在培养过程中会向培养基中分泌蛋白质。人们利用微生物的这种特性,从发酵后的培养基中获取特定的产物,例如从枯草芽孢杆菌培养液上清中制备淀粉酶,或者从里氏木霉发酵产物中获得纤维素酶。鉴定评价微生物对特定蛋白质分泌能力的技术,是筛选获得高效分泌目的蛋白质微生物菌株的关键技术。通常根据某一微生物所分泌特定蛋白质的性质来设计微生物菌株筛选方案。常用的技术有基于酶和底物反应的底物降解法,或基于抗原抗体反应的免疫学方法。例如筛选微生物淀粉酶分泌能力的降解圈法;筛选纤维素分泌能力的刚果红染色法;筛选抗菌肽分泌能力的抑菌圈法。基于免疫学方法对微生物分泌蛋白质能力的评价,目前的技术手段需要在水相溶液中进行,例如酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫比浊法(TIA)。这就需要首先对微生物进行液体培养,再通过上述两种方法,测定培养基上清中目的蛋白质浓度,评价微生物对目的蛋白质分泌能力。虽然这种技术手段能够应用于任何评价任何一种微生物蛋白质的分泌能力,是一种不具有蛋白质种类特异性的通用技术手段。但是这一方法需要首先将在固体平板培养基上获得的单菌落,进一步转移到液体培养基中进行培养。这一过程需要人工挑选菌落接种于液体培养基中进行培养,导致过程繁琐,筛选通量较低。其次酶联免疫吸附法和免疫比浊法相对于固体平板培养基的脱色圈法或抑菌圈法,又不是一种直观的方法,进一步造成大规模筛选耗时较长,筛选通量较小。
技术实现思路
本专利 ...
【技术保护点】
1.一种筛选具有高蛋白质分泌能力的微生物的方法,其特征在于,包括如下步骤:S1、准备与待定微生物所分泌蛋白质能够发生反应的多克隆抗体血清;S2、选定固体培养基,并将固体培养基在115℃~121℃条件下高温灭菌处理30min~40min;待固体培养基降温至50℃~60℃时,向固体培养基中加入多克隆抗体血清,搅拌均匀后,倾倒入固体培养皿中,待用;S3、将待定微生物进行稀释后,涂布于固体培养皿中进行单菌落分离培养;S4、观察单菌落生长过程中所分泌蛋白质与多克隆抗体血清中的多克隆抗体中和反应形成的沉淀圈大小;S5、根据沉淀圈与单菌落的直径比值,分析筛选得到具有高蛋白质分泌能力的微生物。
【技术特征摘要】
1.一种筛选具有高蛋白质分泌能力的微生物的方法,其特征在于,包括如下步骤:S1、准备与待定微生物所分泌蛋白质能够发生反应的多克隆抗体血清;S2、选定固体培养基,并将固体培养基在115℃~121℃条件下高温灭菌处理30min~40min;待固体培养基降温至50℃~60℃时,向固体培养基中加入多克隆抗体血清,搅拌均匀后,倾倒入固体培养皿中,待用;S3、将待定微生物进行稀释后,涂布于固体培养皿中进行单菌落分离培养;S4、观察单菌落生长过程中所分泌蛋白质与多克隆抗体血清中的多克隆抗体中和反应形成的沉淀圈大小;S5、根据沉淀圈与单菌落的直径比值,分析筛选得到具有高蛋白质分泌能力的微生物。2.如权利要求1所述的筛选具有高蛋白质分泌能力的微生物的方法,其特征在于,所述多克隆抗体血清内包含与待定微生物所分泌蛋白质能够发生反应的多克隆抗体。3.如权利要求1所述的筛选具有高蛋白质分泌能力的微生物的方法,其特征在于,所述待定微生物为基因重组毕赤酵母,所述基因重组毕赤酵母能够分泌人C-反应蛋白。4.如权利要...
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