一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌及应用制造技术

本发明专利技术属于基因生物工程领域，具体涉及一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌及应用。本发明专利技术提供的工程菌株毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115‑xyl‑Mut

【技术实现步骤摘要】
一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌及应用
本专利技术属于基因生物工程领域，具体涉及一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌及应用。
技术介绍
木聚糖是构成半纤维素的重要组分，而半纤维素则是植物细胞壁结构的第二大碳水化合物，在玉米芯、麦麸等农业副产物中含量尤其丰富。木聚糖酶(EC3.2.1.8)科学命名法称之为内切-1，4-β-木聚糖酶，作为一类糖苷水解酶，负责催化断裂木聚糖中的β-1,4糖苷键，将结构复杂的木聚糖分解成小分子的低聚木糖和木糖。木聚糖酶在诸多领域都有着较为广泛的应用。如用在动物饲料行业中，可分解植物细胞壁，有效缓解由饲料中木聚糖、β-葡聚糖等非淀粉类多糖引起的抗营养作用。此外，还可降低饲料中的纤维黏度，改善饲料的消化吸收效率，提高家禽动物的体重。在面包等食品烘焙行业中，木聚糖酶能将大分子量的水不溶性阿拉伯木聚糖降解为水溶性的阿拉伯木聚糖，与其它酶制剂协同作用来改良面制品的品质；此外还可在纸浆行业中用做生物漂白剂。然而，大多数工业过程的实现都伴随着高温和极端pH。如在饲料制备过程中，通常需要经过短暂高温(约75～93℃)处理阶段，而市场上在售的木聚糖酶最适温度普遍在40～60℃左右，高于90℃时，酶活完全丧失。不耐高温的特性限制了木聚糖酶的利用。另外，饲料在被单胃动物摄入后，到达肠道才能发挥作用。这就要求木聚糖酶在穿越胃部较强的酸环境到达作用部位小肠后，仍需保持较高活性。而动物胃部pH一般在2～7之间，目前在售的木聚糖酶最适pH一般在5～7，耐酸性差，很难在实际饲料添加过程中发挥优势，长期以来该主要营养成分一直未得到有效利用。所以耐热，耐酸型的木聚糖酶日益受到市场的青睐。研究人员尝试在生物信息学工具的辅助下，寻找编码耐热、耐酸、高活性木的木聚糖酶基因，越来越多的满足这一要求的嗜热微生物被筛选和分离出来，如热解纤维菌属(Caldicellulosiruptorsp.)，嗜热脂肪芽孢杆菌属(Bacillusstearothermophilus)，海洋红嗜热盐菌(Rhodothermusmarinus)，嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)，栖热袍菌属(Thermotogasp.)等。但由于自然筛选的原始菌株的培养条件并不适于工业发酵，且后期对酶的分离纯化复杂，并不适合作为工程菌运用于工业生产当中。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌，所述的菌株已于2018年5月9日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCCNO：M2018258，分类命名：毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115-xyl-Muts-5，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的另一目的在于提供一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌的应用，包括利用本专利技术提供的菌株制备木聚糖酶。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种高表达耐酸耐高温木聚糖酶的毕赤酵母工程菌的构建：申请人将木聚糖酶基因进行优化后克隆到pPIC9k载体上，重组表达载体线性化后电转入P.pastorisGS115感受态细胞中，G418浓度逐渐提高至8mg/mL以获得高拷贝转化子，然后再将该转化子制成感受态进行二次转化，最终得到高表达酶活菌株P.pastorisGS115-xyl-Muts-5，该菌株在28℃下，甲醇和山梨醇按照质量比10:1作为诱导剂混合添加时产酶活性最高。经50L发酵罐高密度发酵后产酶活性达到139.54×103U/mL，高于市场上现有工程菌的最高酶活6.00×103U/mL。以上所述菌株已于2018年5月9日，送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCCNO：M2018258，分类命名：毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115-xyl-Muts-5，地址：中国武汉武汉大学。所构建毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115-xyl-Muts-5工程菌株最适生长及诱导表达温度为28-30℃，温度超过32℃不利于菌株生长，造成木聚糖酶酶活降低。需氧，生长培养基为YPD培养基，BMGY、BMMY培养基用来进行木聚糖酶表达。菌体倍增时间约为2h，甲醇诱导阶段，倍增时间扩大至4-6h。所制备的新型耐酸耐高温型木聚糖酶的酶学性质为：最适反应温度为85℃，最适反应pH为2.4。在70℃下处理该木聚糖酶60min，酶活性达到95％以上；80℃下处理30min，酶活性在80％以上。90℃下处理2min，酶活性在95％以上。在pH1.7到8.0之间处理60min剩余酶活性在70％以上。可以看出，该酶具有耐高温和耐酸性的优点，解决了目前饲料工业中所用木聚糖酶在生产过程中的高温加工处理阶段和动物肠胃的酸性条件下酶活急剧下降的难题。一种高表达木聚糖酶毕赤酵母工程菌的摇瓶发酵方法，包括：将活化后的毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115-xyl-Muts-5在100mLBMGY培养基中培养至OD600为3.8-4.5后，转接至100mLBMMY培养基中(含终浓度为0.5％的吐温80)，26-28℃进行诱导发酵，每10-12h补加质量比为10:1的甲醇与山梨醇的混合液0.5mL一种高表达木聚糖酶毕赤酵母工程菌的高密度发酵方法，包括以下步骤：1.菌体生长阶段将P.pastorisGS115-xyl-Muts-5种子液接种至装有BSM培养基的发酵罐中，在发酵起始阶段设置转速300-350rpm，用氨水调节pH至4.5-5.5，温度28-32℃，当BSM培养基中的甘油消耗完且DO降低后又急剧上升至100％时，进入连续补甘油阶段，设置转速450-550rpm，以恒定的速率补加含有1.2％PTM1的50％甘油；2.甲醇诱导表达阶段当溶氧上升至100％后先让菌体饥饿1-1.5h，待甘油完全耗尽，此时开始甲醇诱导，设置搅拌速度600-800rpm，甲醇的添加量为0.8-1.2mL/h/L；整个阶段使DO值尽量稳定在10％～20％之间，并保持该速率至发酵结束，所述甲醇含有1.2％的PTM1微量盐。一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌的应用，包括利用本专利技术提供的菌株或其发酵上清液制备木聚糖酶。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术所提出的制备耐酸耐高温型木聚糖酶方法的优势在于：①酶活性高。所构建的工程菌P.pastorisGS115-xyl-Muts-5，经50L发酵罐高密度发酵后木聚糖酶活性达到139.54×103U/mL,远高于市场上现有工程菌的最高酶活6.00×103U/mL。②所表达的新型木聚糖酶耐酸耐高温。经酶学性质研究证实，该新型木聚糖酶最适反应温度为85℃，最适pH为2.4，且该酶在80℃下处理30min，酶活性仍在80％以上。解决了目前饲料工业中所用木聚糖酶在生产过程中的高温加工处理阶段和动物肠胃的酸性条件下酶活急剧下降的难题。附图说明图1为木聚糖酶的温度耐受曲线。图2为木聚糖酶的pH耐受曲线。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的具体说明，不是对本专利技术的限制。下面结合附图及具体实施例子对本专利技术作进一步的说明。本专利技术所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本专利技术中未详细阐述的内容请参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌，所述菌株的保藏编号：CCTCC NO：M2018258，分类命名：毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115‑xyl‑ Muts‑5。

【技术特征摘要】
1.一种产耐酸耐高温型木聚糖酶的基因工程菌，所述菌株的保藏编号：CCTCCNO：M2018258，分类命名：毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115-xyl-Muts-5。2.权利要求1所述的基因工程菌的摇瓶发酵方法，包括：将权利要求1所述基因工程菌在100mLBMGY培养基中培养至OD600为3.8-4.5后，转接至100mLBMMY培养基中(含终浓度为0.5%的吐温80)，26-28℃进行诱导发酵，每10-12h补加甲醇与山梨醇的混合液0.5mL；所述的混合液中甲醇与山梨醇的质量比10:1。3.权利要求1所述的基因工程菌的的高密度发酵方法，包括以下步骤：1）.菌体生长阶段将权利要求1所述基因工程菌种子液...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭楠，葛向阳，赵述淼，梁运祥，田建平，
申请(专利权)人：四川润格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51