共利用葡萄糖和木糖产生木糖醇的工程菌株的构建及应用制造技术

本发明专利技术为共利用葡萄糖和木糖产生木糖醇的工程菌株的构建及应用，发现己糖激酶KmHXK敲除的耐热酵母中葡萄糖抑制效应得到很大程度的消除，实现了多种糖与葡萄糖共利用，通过过表达葡萄糖激酶KmGLK可以恢复KmHXK敲除后葡萄糖代谢受到的影响，本发明专利技术中发现该菌仍然保持葡萄糖抑制效应解除的特征，可以作为平台菌株；本发明专利技术以该平台菌株成功获得能够高效共利用葡萄糖和木糖生产木糖醇的耐热酵母菌株YHY013，其保藏号为CGMCC No.15347。所述菌株在42℃的条件下可以有效利用木糖母液或玉米芯水解液等天然发酵底物中的葡萄糖和木糖发酵生产木糖醇，且利用玉米芯水解液产木糖醇的产量超过已报道的其他菌株。

【技术实现步骤摘要】
共利用葡萄糖和木糖产生木糖醇的工程菌株的构建及应用
本专利技术涉及到生物
具体地，本专利技术发现己糖激酶KmHXK敲除的耐热酵母中葡萄糖抑制效应得到很大程度的消除，实现了多种糖与葡萄糖共利用，通过过表达葡萄糖激酶KmGLK可以恢复KmHXK敲除后葡萄糖代谢受到的影响，本专利技术中发现该菌仍然保持葡萄糖抑制效应解除的特征，可以作为平台菌株；本专利技术在该平台菌株的基础上，对该菌的木糖代谢路径进行改造，成功获得能够高效共利用葡萄糖和木糖生产木糖醇的耐热酵母菌株YHY013，其保藏号为CGMCC15347。该菌株能够在高温条件下有效利用木糖母液或玉米芯水解液等天然发酵底物中的葡萄糖和木糖发酵生产木糖醇，且利用玉米芯水解液生产木糖醇的产量超过已报道的菌株。
技术介绍
包括玉米芯在内的农业废弃物是一种非常有发展潜力的生物质类能源，通过水解预处理可将其分为固体的玉米芯残渣(CCR)和上清水解液两部分。CCR由于其中富含葡萄糖所以一般用来生产生物乙醇，而水解液中木糖占总糖的90％，因此一般用来结晶提取木糖，提取出来的纯木糖可作为现在工业生产木糖醇的原料(Balan，2014；Beheraetal.，2014；Isikgor&Becer，2015)。从玉米芯水解液中提取木糖后剩余的粘稠液体即木糖母液，其总糖含量在60-75％之间，木糖占总糖的50-70％，葡萄糖占总糖约8-10％，但是由于木糖母液中成分复杂且杂糖含量很高，使其中木糖很难被利用，一般作为废液处理，不仅造成了环境污染也是一种能源浪费。不同于工业上的化学催化法，生物法生产木糖醇不需要纯木糖作为原料(Mohamadetal.，2014)，因此木糖母液或许可以直接通过生物法加以利用来生产木糖醇，而直接利用玉米芯水解液可以减少木糖的结晶纯化过程，进一步降低成本。这样既节省了资源，同时也减少了污染，和贯彻了科学发展和可持续发展的思想。耐热酵母Kluyveromycesmarxianus(马克斯克鲁维酵母)用于工业发酵生产木糖醇有如下几个优点：1.是一种GRAS(generalregardingassafe)级别的酵母，因此可以用于食品药品生产；2.能够利用多种糖类生长发酵包括木糖；3.能在高温下快速生长和发酵，从而降低了工业发酵中的冷却费用同时大大减少了菌株污染的可能性(Kumaretal.，2009)。由于马克斯克鲁维酵母有很多比酿酒酵母优秀的品质，马克斯克鲁维酵母被越来越多的用于生物能源的生产(Fonsecaetal.，2008)。所以利用马克斯克鲁维酵母发展成木糖醇生产菌株具有非常重要的应用价值。马克斯克鲁维酵母本身虽然可以利用木糖作为碳源，但是当碳源中混合有葡萄糖时马克斯克鲁维酵母会优先利用葡萄糖并抑制木糖代谢，木糖母液和玉米芯水解液中含有丰富木糖的同时也都含有葡萄糖，因此如何解除耐热酵母的葡萄糖抑制效应实现葡萄糖和木糖的共利用成为木糖母液和玉米芯水解液等生物质利用的关键。已经有一些关于对生物质中葡萄糖和木糖实现共利用的研究，由于酿酒酵母的基因组信息以及代谢路径被研究的比较清楚，因此很大部分研究都是围绕酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)展开，主要研究思路是通过改造葡萄糖信号通路中的一些关键基因表达，同时外源表达一些非葡萄糖的转运蛋白以及代谢相关基因，实现葡萄糖和非葡萄糖碳源的共利用(Kogje&Ghosalkar，2016；Ohetal.，2013；Santangelo，2006)。但是关于耐热酵母，这方面的工作才刚刚开始。本专利技术人之前的研究通过在马克斯克鲁维酵母中表达外源木糖特异性转运蛋白实现了葡萄糖和木糖共利用，得到的最终菌株YZJ119最高可以利用玉米芯(包括玉米芯残渣(CCR)和水解液两部分)同时产生44.58g/L的乙醇和32.03g/L的木糖醇(Zhangetal.，2016)，但是该菌株的葡萄糖和木糖共利用只是在糖转运层面上实现的，还没有充分发挥耐热酵母的葡萄糖和木糖共利用能力。因此，本领域中仍需要开发具有更高的木糖醇生产能力并且能够利用玉米芯水解液等生物原料产生木糖醇的耐热菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种能够共利用葡萄糖和木糖生产木糖醇的耐热工程酵母菌株。具体而言，本专利技术构建一种具有更高的木糖醇生产能力并且能够利用玉米芯水解液等生物原料产生木糖醇的耐热工程酵母菌株。本专利技术人通过对比不同基因敲除对耐热酵母(Kluyveromycesmarxianus)的葡萄糖抑制效应影响发现了己糖激酶(hexokinase，KmHXK)在该路径中的重要作用，发现己糖激酶KmHXK敲除很大程度上消除了耐热酵母的葡萄糖抑制效应，该菌株可以作为平台菌株实现包括木糖在内的多种糖与葡萄糖共利用；平台菌株结合木糖代谢路径的改造进一步提高了葡萄糖和木糖共利用发酵生产木糖醇的能力；最终改造菌株在以豆粕粉和玉米浆混合物作为氮源的培养基中能有效利用木糖母液或玉米芯水解液生产木糖醇；这是目前葡萄糖和木糖共利用效果最好的耐热酵母工程菌(表2)，是第一次通过耐热酵母马克斯克鲁维酵母对木糖母液进行利用生产木糖醇的尝试，且效果较好(表3)，同时也是目前利用玉米芯水解液生产木糖醇产量最高的酵母(表3)；证明了本专利技术的最终菌株在木糖母液和玉米芯水解液等生物质的工业利用上的优势。本专利技术通过对比不同基因敲除对耐热酵母马克斯克鲁维酵母葡萄糖效应的影响，发现己糖激酶基因(KmHXK)的敲除可以解除葡萄糖对多种糖利用的抑制效应；发现通过过表达葡萄糖激酶KmGLK恢复KmHXK敲除菌对葡萄糖代谢能力的同时保持了葡萄糖抑制效应解除的特征；这样的菌株可以作为平台菌株，在很多生物质的开发利用中发挥作用；而在酿酒酵母中被认为控制葡萄糖抑制效应的基因ScMIG1的对应基因KmMIG1的敲除，却不能解除葡萄糖对木糖利用的抑制。本专利技术在该平台菌株中组成型表达脉孢霉(Neurosporacrassa)的木糖还原酶基因(xylosereductasegenes，NcXYL1)，葡萄糖效应解除结合外源木糖还原酶组成型表达，大幅度提高了耐热酵母马克斯克鲁维酵母共利用葡萄糖和木糖生产木糖醇的能力；再通过过表达木糖特异性转运蛋白(ScGal2N376F)进一步提高葡萄糖和木糖的共利用，构建了葡萄糖和木糖共利用能力大幅提高，能够以豆粕粉和玉米浆混合物为氮源利用木糖母液或玉米芯水解液生产木糖醇的耐热工程酵母菌株。构建过程见图1。本专利技术最后用于利用木糖母液或玉米芯水解液发酵产生木糖醇的应用菌株为YHY013。此菌株可以高效地共利用葡萄糖木糖生产木糖醇，能以豆粕粉和玉米浆混合物为氮源直接利用木糖母液或玉米芯水解液发酵生产木糖醇。上述耐热工程酵母菌株已于2018年2月7日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其对应的保藏号为CGMCCNo.15347，命名为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)YHY013菌株。总的来说，本申请从木糖代谢层面解除葡萄糖抑制从而得到平台菌株，在平台菌株的基础上再结合木糖代谢其它相关改造从而获得了YHY013菌株，相比于本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够共利用葡萄糖和木糖生产木糖醇的耐热工程酵母菌株，其保藏号为CGMCC No.15347。

【技术特征摘要】
1.一种能够共利用葡萄糖和木糖生产木糖醇的耐热工程酵母菌株，其保藏号为CGMCCNo.15347。2.权利要求1所述的耐热工程酵母菌株，其能够直接利用木糖母液或玉米芯水解液发酵产生木糖醇。3.一种生产木糖醇的方法，所述方法包括将保藏号为CGMCCNo.15347的菌株接种在包含葡萄糖和木糖的培养基中进行发酵培养，从发酵液中提取得到木糖醇。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述发酵在发酵罐中进行，发酵温度为42℃。5.根据权利要求4所述的方法，其中在发酵过程中，前12小时的搅拌速度为300rpm，之后搅拌速度控制...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪泂，华艳，王冬梅，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34