本发明专利技术涉及合成生物学领域，特别涉及基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用。本申请人基于LoxPsym位点特异性重组的合成型基因组重排系统(SCRaMbLE)在单倍体合成型酿酒酵母中进行基因组重排发现YER151C基因的缺失对脱氧紫色杆菌素前体产量的增加有影响。并且通过全基因组测序验证了YER151C基因缺少与脱氧紫色杆菌素前体生产相关。因此本发明专利技术提供了YER151C基因的缺失及其应用、缺失该基因(YER151C)的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用。
【技术实现步骤摘要】
一种菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用
本专利技术涉及合成生物学领域，具体涉及基因的缺失及其应用、缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用。
技术介绍
紫色杆菌素(violacein，Vio)是一种主要由革兰氏阴性菌代谢生成的天然紫色颜料物质，最早在青紫色素杆菌(Chromobacteriumviolaceum)中被分离得到，在其它细菌中这种青紫色色素也被观察到，如藤黄紫假交替单胞菌(Pseudoalteromonasluteoviolacea)和Pseudomonassp.520P1and710P1等。该物质的化学结构在1960年被Ballantine等人进行了完整的阐述，并成功将其化学合成出来，一般来说，紫色杆菌素包括3个结构单元，即1分子的5-羟基吲哚，1分子的2-羟基吲哚，还有一分子的2-吡咯烷酮，故又称其为双吲哚类化合物。紫色杆菌素不仅具有良好的着色效果，可作为生物染料，有很好的应用前景。紫色杆菌素还具有广谱抗菌、抗病毒、抗氧化、抗原生动物、抗肿瘤等多种重要生物活性，可作为潜在的抗肿瘤、抗病毒药物及保健类天然色素。目前微生物生产紫色杆菌素的产量普遍较低。而且从生物中提取得到的紫色杆菌素很难将其分离纯化，一般除了紫色杆菌素之外，还含有较高浓度的脱氧紫色杆菌素。脱氧紫色杆菌素是比紫色杆菌素少一个氧原子的结构类似物，通常伴随紫色杆菌素产生，是紫色杆菌素合成途径的副产物。脱氧紫色杆菌素前体(prodeoxyviolacein，PDV)是紫色杆菌素合成路径的关键中间产物，可在VioC的氧化作用下产生脱氧紫色杆菌素，在VioD的氧化作用下生成紫色杆菌素前体。紫色杆菌素前体在氧化酶VioC的催化作用下最终生成紫色杆菌素。因此，提供产量高的脱氧紫色杆菌素前体的菌株及合成方法对紫色杆菌素的合成具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供产量高的脱氧紫色杆菌素前体的菌株及合成方法，以提高脱氧紫色杆菌素前体的产量。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了基因YER151C的缺失在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。进一步的，作为优选，所述微生物为酵母，所述次级代谢产物为芳香族氨基酸下游代谢产物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述次级代谢产物为脱氧紫色杆菌素前体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述微生物为合成脱氧紫色杆菌素前体的酵母菌株。本专利技术还提供了菌株，其基因YER151C被敲除。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述菌株其为合成脱氧紫色杆菌素前体的酵母菌株。在此基础上，本专利技术还提供了所述的菌株在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。作为优选，所述次级代谢产物为芳香族氨基酸下游代谢产物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述次级代谢产物为脱氧紫色杆菌素前体。进一步，本专利技术还提供了脱氧紫色杆菌素前体的合成方法，本专利技术提供的菌株经发酵培养，收集发酵产物。本申请人基于LoxPsym位点特异性重组的合成型基因组重排系统(SCRaMbLE)在单倍体合成型酿酒酵母中进行基因组重排发现YER151C基因的缺失对脱氧紫色杆菌素前体产量的增加有影响。并且通过全基因组测序验证了YER151C基因缺少与脱氧紫色杆菌素前体生产相关。因此本专利技术提供了YER151C基因的缺失及其应用、缺失该基因(YER151C)的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1pCAN-A质粒图；图2示实施例1pCAN-B质粒图；图3示实施例1pVioABE质粒图；图4示实施例1整合脱氧紫色杆菌素路径示意图(a)和酵母菌在整合脱氧紫色杆菌素路径后，在固体培养基上生长形成绿色的菌落(b)；图5示实施例2单倍体酵母在5轮迭代基因组重排中的表型频率；图6示实施例2多轮重排后得到的菌株，在5mlSC培养基中30℃220rpm摇床发酵培养12h后的表型展示图；图7示实施例2多轮重排后得到的菌株，在50mLSC培养基中30℃220rpm摇床发酵培养72h后HPLC进行脱氧紫色杆菌素前体相对定量的结果；图8示实施例3线型合成型V号菌株yWJR006、yWJR040、yWJR085、yWJR104全基因组深度测序结果比较；图9示实施例4“His”标签替换YER151C的示意图；图10示实施例4基因改造菌株yWJV003的单菌落颜色展示；图11示实施例4基因改造菌株yWJV003脱氧紫色杆菌素前体相对定量。具体实施方式本专利技术公开了基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1、申请人设计构建了3个质粒：pCAN-A,pCAN-B和pVioABE(图1-3)。然后使用HindIII与SacI对pCAN-A,pCAN-B进行酶切回收片段，使用EcoRI对pVioABE进行酶切回收片段。将这三个DNA片段混合在一起，对合成型5号染色体酵母进行酵母转化(图4)，可以将VioABE代谢路径与Leu2营养标记一起整合到synV中的YEL063C/CAN1基因座中。涂在SC-His平板上，在30℃培养3天，获得绿色的酵母菌落yWJR001。实施例2、基因组重排筛选高产脱氧紫色杆菌素前体1.接3个单菌落分别到5mLSC-His(葡萄糖)液体培养基的试管里，作为3个生物学平行，30℃220rpm摇菌过夜培养，使细胞生长至对数生长期；2.测量上述菌液的OD600值，后5000rpm，2min离心细胞，ddH2O水洗一次，转接到5mLSGal-His(半乳糖)液体培养基中，使终OD值在0.5-0.6左右；3.在上述5mLSGal-His(半乳糖)液体培养基中加入1μL0.5mM的雌二醇(乙醇溶液)，对照中只加入1μL无水乙醇，后将实验组和对照组试管放置于30℃220rpm的恒温培养箱中培养；4.取样时间根据菌株类型有所区别，本专利技术中均在8h取样，取500μL菌液5000rpm，2min离心，收集菌体细胞，ddH2O水洗三次，彻底洗掉残留的雌二醇和半乳糖培养基，用500μLddH2O重悬，取样后一般稀释104-105倍涂布平板，取100μL稀释后的菌液涂布SC-His(葡萄糖)的固体培养基平板，挑选比亲本菌株颜色更深的菌株进行发酵。5.取三个独立的菌落接种到5mLSC培养基中培养24小时，然后以OD600为0.1接种于50mL的SC培养基(40g/L葡萄糖)，在30℃，220rpm摇床中发酵培养72小时。6.离心收集2mL发酵培养物，并用500μL色谱纯甲醇从沉淀中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基因YER151C的缺失在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。
【技术特征摘要】
1.基因YER151C的缺失在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物为酵母，所述次级代谢产物为芳香族氨基酸下游代谢产物。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述次级代谢产物为脱氧紫色杆菌素前体。4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述微生物为合成脱氧紫色杆菌素前体的酵母菌株。5.菌株，其特征在于，其基因YER151C被敲除。6.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，贾斌，王娟，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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