一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法技术

本发明专利技术属于生物催化技术领域，具体涉及一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法。本发明专利技术将植物甾醇代谢途径中甾醇C27位单加氧酶Cyp125引入到甾体转化微生物中，以提高重组微生物在发酵系统中雄烯二酮的转化效率，为解决菌体植物甾醇代谢缓慢提供了新方法。Cyp125的过表达促进分枝杆菌甾醇C27单加氧酶比酶活提高了22.2％，提高了胞内NAD

【技术实现步骤摘要】
一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法
：本专利技术属于生物催化
，具体涉及一种提高分枝杆菌辅酶再生同时促进雄烯二酮生产的方法。
技术介绍
：雄烯二酮，雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，是生产可的松、盐皮质激素类药物、常规口服避孕药和蛋白同化激素等其他甾体激素类药物的重要中间体，可以通过微生物降解植物甾醇侧链获得。植物甾醇代谢生成AD(D)的代谢途径复杂，不仅受自身代谢途径的影响也受胞内辅酶的调控。目前基于植物甾醇代谢途径分析提高AD(D)生产的策略主要包括：1、植物甾醇代谢途径中关键酶的改造；2、对植物甾醇代谢途径依赖的辅酶再生系统进行调控。关于植物甾醇代谢途径中酶的改造，主要集中于通过过表达或敲除植物甾醇氧化途径中的酶来提高AD(D)生产效率及产量。例如过表达胆固醇氧化酶及3β-羟基甾体脱氢酶等，或失活3-酮甾体-9α-羟化酶以及3-酮甾体-1-脱氢酶。研究结果显示敲除某基因以后，会在不同程度上降低植物甾醇的转化率和产率，即造成菌体整体生产强度的下降。因此还需要从菌体整体代谢调控方面深入探索、系统研究，以寻求提高雄烯二酮生产效率的方法。植物甾醇代谢途径中许多关键酶属于辅酶依赖型酶，辅因子依赖的代谢途径不仅受代谢途径中酶的控制，而且还受辅因子浓度及辅因子氧化还原态比例的控制。前期研究通过调控微生物中辅酶再生系统来促进AD(D)生产效率，通过过表达NADH氧化酶促进胞内NAD+的再生，结果表明AD(D)的生成量有所提高，但是菌体生长受到了明显的抑制，使AD(D)的生产周期延长(SuLQ,ShenYB,ZhangWK,GaoT,ShangZH,WangM(2017)CofactorengineeringtoregulateNAD+/NADHratiowithitsapplicationtophytosterolsbiotransformation.MicrobCellFact16(1):182-192)。微生物甾醇或胆固醇侧链降解开始于C27位羟基化进而氧化为C27位羧酸，甾醇C27单加氧酶(Cyp125)属于细胞色素P450酶，依赖NADH为辅酶催化甾醇侧链末端C进行连续的氧化反应，起始甾醇侧链降解途径。
技术实现思路
：为了解决上述问题，探索一种提高分枝杆菌AD(D)生产效率的方法，对植物甾醇代谢途径及调控途径综合考虑是有必要的。植物甾醇代谢途径中甾醇C27位单加氧酶Cyp125是依赖还原型辅酶NADH的酶，属于植物甾醇侧链降解途径初始酶，本专利技术将其引入到甾体转化微生物中，以提高重组微生物在发酵系统中雄烯二酮的转化效率，为解决菌体植物甾醇代谢缓慢提供了新方法。本专利技术实现上述目的的技术方案如下：一种产雄烯二酮的基因工程菌，是以新金分枝杆菌为宿主细胞，过表达甾醇C27单加氧酶基因cyp125-3获得的；所述cyp125-3的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；优选地，所述宿主细胞为新金分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)MNRM3，该菌株可从中国工业微生物菌种保藏管理中心(简称CICC)购买获得，编号CICC21097；优选地，表达载体为质粒pMV306；所述以CICC21097为宿主细胞，以质粒pMV306为表达载体过表达甾醇C27单加氧酶基因cyp125-3获得的基因工程菌命名为MNRM3C3。所述产雄烯二酮的基因工程菌的构建方法，具体如下：(1)将cyp125-3基因(SEQIDNO.1)和质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-cyp125-3重组质粒；(2)将重组质粒pMV261-cyp125-3及质粒pMV306进行酶切，回收pMV261-cyp125-3中的启动子和目的基因片段，与酶切后的pMV306连接，构建pMV306-cyp125-3重组质粒；(3)将重组质粒pMV306-cyp125-3导入新金分枝杆菌的感受态细胞中，获得的阳性转化子即为本专利技术新构建的基因工程菌株；优选地，所述新金分枝杆菌为CICC21097，所述产雄烯二酮的基因工程菌为MNRM3C3。本专利技术提供的技术方案之二，是利用上述构建的MNRM3C3菌株发酵生产雄烯二酮的方法，具体如下：将MNRM3C3经种子培养后，按5-10％(v/v)的接种量接种入发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH6.5-7.8条件下，发酵4-6天；所述发酵培养基组成如下：K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，羟丙基β-环糊精25mM，植物甾醇3g/L，其余为水，pH6.5-7.8；发酵4-6天后，AD(D)产量达到1.82-1.98g/L，转化率可以达到100％。有益效果：本专利技术利用过表达甾醇C27位单加氧酶Cyp125,促进分枝杆菌甾醇C27单加氧酶比酶活提高了22.2％左右，提高了胞内NAD+的再生，使胞内NAD+/NADH比例提高131％，同时意外的发现该酶的过表达使菌体生物量提高18.7％，最终达到使转化周期由120h缩短至96h，AD(D)产量提高10.0％的效果。附图说明：图1cyp125-3基因扩增电泳图；M：DL5000DNAMarker；1，2：cyp125-3基因扩增条带。图2阳性转化子MNRM3C3菌液PCR验证图；M：DL5000DNAMarker；1，2：阳性转化子MNRM3C3菌液PCR扩增条带。图3原始菌株MNRM3及重组菌株MNRM3C3生长(a)，NAD+(b)，NADH(c)，NAD+/NADH(d)变化曲线图。图4原始菌株MNRM3及重组菌株MNRM3C3AD(D)生成(a)及底物消耗过程图(b)。图5阳性转化子pMV261-cyp125-3质粒双酶切验证图；M：DL5000DNAMarker；1，2：阳性转化子pMV261-cyp125-3质粒双酶切条带。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本专利技术。实施例1重组菌株MNRM3C3的构建1、构建pMV306-cyp125-3质粒，其过程包括：(1)合成目的基因，根据分枝杆菌M3甾醇C27位单加氧酶基因cyp125-3的核苷酸序列(SEQIDNO.1),将酶切位点(BamHI及HindIII)添加于cyp125-3序列的两端，将所设计的序列交由金唯智公司进行基因合成；(2)PCR扩增目的基因片段cyp125-3基因(验证图为图1)，目的片段cyp125-3及质粒pMV261分别用BamHI和HindIII双酶切，纯化，连接获得重组质粒pMV261-cyp125-3。(3)将重组质粒pMV261-cyp125-3及表达质粒pMV306用XbaΙ和HindIII进行双酶切，胶回收pMV261-cyp125-3中启动子和目的基因片段，与酶切后的pMV306连接获得重组质粒pMV306-cyp125-3。2、构建菌株MNRM3C3：(1)分枝杆菌MNRM3感受态细胞制备：一级种子培养至OD600为1.0左右,按10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.甾醇C27单加氧酶基因cyp125‑3在提高新金分枝杆菌中雄烯二酮产量中的应用，其特征在于，通过在新金分枝杆菌中过表达cyp125‑3基因实现。

【技术特征摘要】
1.甾醇C27单加氧酶基因cyp125-3在提高新金分枝杆菌中雄烯二酮产量中的应用，其特征在于，通过在新金分枝杆菌中过表达cyp125-3基因实现。2.一种产雄烯二酮的基因工程菌，其特征在于，是以新金分枝杆菌为宿主细胞，过表达甾醇C27单加氧酶基因cyp125-3获得的。3.权利要求2所述的一种产雄烯二酮的基因工程菌，其特征在于，所述新金分枝杆菌具体为新金分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)MNRM3，编号CICC21097。4.权利要求2所述的一种产雄烯二酮的基因工程菌，其特征在于，表达载体为质粒pMV306。5.权利要求2-4任意一项所述产雄烯二酮的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体如下：(1)将cyp125-3基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-cyp125-3重组质粒；(2)将重组质粒pMV261-cyp125-3及质粒pMV306进行酶切，回收pMV261-cyp125-...

【专利技术属性】
技术研发人员：申雁冰，王敏，苏立秋，夏梦雷，骆健美，商志华，许双平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12