大肠杆菌基因工程菌及其发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的用途制造技术

本发明专利技术提供一种同步高产L‑色氨酸与L‑缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌及其用途。所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组上，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入trpE(S40F)突变；将由Ptrc启动子控制的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点；将由Plac启动子控制的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点；将由Plac启动子控制的glnA基因整合至ycjV假基因位点；再将Ptrc启动子控制的枯草芽孢杆菌alsS基因整合至yghx假基因位点获得。利用该菌株进行摇瓶发酵可在22‑28h内积累L‑色氨酸达10‑14g/L，同时缬氨酸积累量达5‑7g/L，总产酸能力比色氨酸生产菌株提高了50％左右，同时菌体OD600相差不大，不存在生长问题，但单位菌体产酸能力明显提高了120％，大大提高了碳源和细胞的有效利用。

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌基因工程菌及其发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的用途
本专利技术涉及一株大肠杆菌基因工程菌以及利用其发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的用途，属于微生物代谢调控和基因工程

技术介绍
L-色氨酸与L-缬氨酸，同属于八种必需氨基酸，因其营养价值，已被广泛用于饲料、食品和药品等领域。色氨酸与缬氨酸的生产方法包括化学合成法、酶反应法、发酵法等，但随着基因工程手段的逐渐完善，利用微生物直接发酵法来生产色氨酸或缬氨酸得到迅速发展，该方法以葡萄糖等低价原料为碳源经微生物发酵生产得到目的产物，生产成本较低，生产工艺相对简单可控。最初诱变育种是氨基酸生产菌株获得的常规手段，随着基因组测序技术的兴起，人们将获得的生产菌株进行测序，得到氨基酸合成途径中已解除反馈抑制的关键酶的基因序列，这为后续代谢工程手段改造大肠杆菌生产氨基酸提供了基础。L-色氨酸的合成代谢途径长而复杂，涉及的前体物较多，很难在野生菌株中积累，色氨酸合成途径涉及到糖酵解途径(EMP)、三羧酸循环(TCA)和磷酸戊糖途径(HMP)，经代谢工程手段强化色氨酸合成途径仅是大肠杆菌生产L-色氨酸生产菌株构建的基础，寻找并实现EMP、TCA和HMP途径之间的动态平衡才可避免因能量失衡带来的各种问题。LinChen和An-PingZeng等人(RationaldesignandmetabolicanalysisofEscherichiacoliforeffectiveproductionofL-tryptophanathighconcentration[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2017,101(2):559-568.)以大肠杆菌W3110为出发菌株，敲除或失活了aroF、aroG、mtr、tnaA、tnaB等基因，同时将带有点突变且解除了反馈抑制的基因aroG(S180F)和serA(H344A，N364A)组成受Ptac调控的操纵子整合至基因组，最后经发酵罐测试，色氨酸可积累27g/L左右，但在发酵时间达36h后，菌体的单位耗糖及产酸能力比原来降低70％左右，文中也并未对其原因进行分析。相较于L-色氨酸，L-缬氨酸的合成途径相对简短直接，丙酮酸为缬氨酸合成的唯一前体物，经第一个关键酶乙酰乳酸合酶(AHAS)催化，进入缬氨酸合成途径，再经三步反应便得到L-缬氨酸。以大肠杆菌为出发菌株构建L-缬氨酸生产菌株，找到高酶活的可解除缬氨酸反馈抑制的AHAS，提高中间代谢物的传递效率是关键，韩国人SangYupLee等人(Fed-BatchCultureofEscherichiacoliforL-ValineProductionBasedonInSilicoFluxResponseAnalysis[J].Biotechnology&Bioengineering,2011,108(4):934.)通过对AHAS中的调节亚基(ilvH)引入特定的点突变，解除缬氨酸对AHAS的反馈抑制，缬氨酸产量明显提升，但是丙酮酸供应是进一步提高缬氨酸产量的瓶颈，因丙酮酸是胞内重要的中间代谢产物，其主要的代谢去向是经丙酮酸脱氢酶复合体催化为乙酰CoA，最终进入TCA循环，为细胞生长提供能量。合理分配丙酮酸的代谢流向，在提高缬氨酸产量的同时避免菌体因能量供应不足生长受阻是在构建缬氨酸生产菌株时需解决的问题。大肠杆菌作为基因工程的重要宿主，其遗传背景清楚，基因操作系统完善，代谢改造大肠杆菌使其成为L-色氨酸生产菌株已成为主流趋势。目前研究L-色氨酸生产菌株代谢改造大部分都是增加PEP和E4P的供给，强化L-色氨酸的合成途径，但是，色氨酸途径的加强，PEP经羧化酶反应成草酰乙酸的代谢流势必会减弱，同时，L-色氨酸合成途径中，分支酸经酶催化为邻氨基苯甲酸会伴随有一分子丙酮酸生成，草酰乙酸供应不足，TCA循环受阻，丙酮酸因不能及时代谢而大量积累，容易造成多种副产物的产生，最终影响细胞生长及目的产物的积累。
技术实现思路
本专利技术目的是实现大肠杆菌发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸，经代谢工程手段对大肠杆菌L-色氨酸生产菌株中L-缬氨酸合成途径中相关基因进行改造，构建一株可同时生产L-色氨酸、L-缬氨酸的基因工程菌株，充分利用L-色氨酸生物合成途径中生成的丙酮酸来合成第二目的产物-L-缬氨酸，不仅在一定程度上解决了因丙酮酸过剩造成的多种副产物积累，同时大大提高了碳源利用率，最终利用其可以实现L-色氨酸和L-缬氨酸的不携带质粒、不添加抗生素、安全、快速、高效的生产，实现碳源的高效利用。在本专利技术中采用如下定义：1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法采用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母缩写形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。2、突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如trpE(S40F)，表示trpE基因所编码的氨基酸序列位置40的氨基酸由亲本的丝氨酸(S)替换成苯丙氨酸(F)。如serA(H344A,N364A)，表示位置344和位置364的氨基酸都发生了突变。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案之一是提供一株同步高产L-色氨酸与L-缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌，概述如下：首先是构建一株能快速高效生产L-色氨酸的基因工程菌E.coliTRP04，在大肠杆菌的基因组上，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入trpE(S40F)突变；将由Ptrc启动子控制的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点；将由Plac启动子控制的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点；将由Plac启动子控制的来自嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)优化后的glnA基因整合至ycjV假基因位点；再以E.coliTRP04为出发菌株，进一步将Ptrc强启动子控制的来自枯草芽孢杆菌的编码乙酰乳酸合酶的基因(alsS)整合至yghx假基因位点，最终得到菌株TV01。代谢简图见附图1。所述大肠杆菌的出发菌株优选为E.coliW3110。上述基因工程菌的构建步骤概述如下：(1)采用大肠杆菌CRISPR/Cas基因编辑技术，以E.coliW3110为出发菌株，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入解反馈抑制的trpE(S40F)基因，强化色氨酸操纵子合成酶系的同时解除关键酶邻氨基苯甲酸合成酶的反馈抑制作用；(2)将Ptrc启动子控制的解反馈抑制的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点，强化关键酶3-脱氧阿拉伯糖庚酮糖酸-7-磷酸合成酶的同时解除其反馈抑制作用；(3)将Plac启动子控制的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点，增加前体物L-丝氨酸合成的同时解除其反馈抑制作用；(4)将Plac启动子控制的优化后的glnA基因整合至ycjV假基因位点，增加前体物L-谷氨酰胺的供应；(5)将Ptrc启动子控制的来自枯草芽孢杆菌的alsS基因整合至yghx假基因位点，强化缬氨酸合成途径，构建基因工程菌E.coliTV01。所述trpE(S40F)基因的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。所述aroG(S180F)基因的核苷酸序列如SEQIDNo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同步高产L‑色氨酸与L‑缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组上，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入trpE(S40F)突变；将由Ptrc启动子控制的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点；将由Plac启动子控制的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点；将由Plac启动子控制的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示的glnA基因整合至ycjV假基因位点；再将Ptrc启动子控制的枯草芽孢杆菌alsS基因整合至yghx假基因位点，获得基因工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种同步高产L-色氨酸与L-缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组上，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入trpE(S40F)突变；将由Ptrc启动子控制的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点；将由Plac启动子控制的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点；将由Plac启动子控制的核苷酸序列如SEQIDNo：4所示的glnA基因整合至ycjV假基因位点；再将Ptrc启动子控制的枯草芽孢杆菌alsS基因整合至yghx假基因位点，获得基因工程菌。2.如权利要求1所述的同步高产L-色氨酸与L-缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以E.coliW3110为出发菌株。3.如权利要求1所述的同步高产L-色氨酸与L-缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述trpE(S40F)基因的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示；所述aroG(S180F)基因的核苷酸序列如SEQIDNo：2所示；所述serA(H344A,N364A)基因的核苷酸序列如SEQIDNo：3所示。4.权利要求1-3任一所述大肠杆菌基因工程菌用于发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的用途。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，利用所述基因工程菌进行摇瓶发酵：将菌种活化后制备种子液，按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1mL60％(m/v)葡萄糖溶液)；发酵周期22-28h；所述发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH4)2SO42-6g/L，KH2PO41-5g/L，MgSO4·7H2O0....

【专利技术属性】
技术研发人员：谢希贤，杜丽红，郝亚男，韩亚昆，门佳轩，陈宁，徐庆阳，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12