一种球囊霉素相关土壤蛋白的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种球囊霉素相关土壤蛋白的分离纯化方法，该方法根据球囊霉素相关土壤蛋白的特性综合使用了酸沉、盐析、超滤、层析、色谱纯化及活性炭吸附等工艺，除去了蛋白中腐殖酸和其它杂质的干扰，大幅提高了球囊霉素相关土壤蛋白的纯度，该方法还具有产物收率高，生产成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种球囊霉素相关土壤蛋白的分离纯化方法
本专利技术涉及蛋白质的制备方法，尤其是球囊霉素相关土壤蛋白的分离纯化方法。
技术介绍
球囊霉素相关土壤蛋白(GRSP)是丛枝菌根(AM)真菌产生的一种糖蛋白物质，其性质稳定，不溶于水，耐高温，在土壤团聚体形成中起重要作用，能够提高土壤团聚体的稳定性。作为一种有机质，GRSP可以为土壤提供大量碳源，能够吸附固定土壤中的重金属，对重金属污染土壤生物修复有重要作用。目前已有研究发现腐殖酸是GRSP中的主要干扰物质，腐殖酸的存在严重影响了GRSP性质及功能。目前对于GRSP的纯化主要是通过简单的物理处理进行初步纯化，能部分除去腐殖酸的干扰，得到的蛋白纯度很低，影响了GRSP的进一步应用，因此如何得到高纯度的GRSP是目前急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高纯度球囊霉素相关土壤蛋白的分离纯化方法。上述目的是通过以下技术方案实现的：一种球囊霉素相关土壤蛋白的分离纯化方法，包括以下步骤：1)提取：将土壤样品用10-100mM的柠檬酸钠溶液进行高温提取，收集提取液；2)酸沉：用酸调节土壤提取液的pH至2-2.5，离心收集沉淀；3)盐析：将沉淀用氢氧化钠溶液溶解，然后向溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到50-80％，盐析后离心收集沉淀；4)超滤：将沉淀用氢氧化钠溶液溶解，用截留分子量为30-100kDa的超滤膜过滤，得到超滤浓缩液；5)层析：将超滤浓缩液上ConA亲和层析柱，先用平衡缓冲液洗脱，再用含有0.1-0.2M凝集素特异性糖的平衡缓冲液洗脱并收集洗脱液，所述平衡缓冲液为5-15mMTris-HCl，0.5-2mMMgCl2，0.5-2mMCaCl2，0.1-0.2MNaCl，pH为7-8；6)色谱纯化：将洗脱液上分子体积排阻色谱柱，用流动相洗脱，紫外检测，分析出峰情况并收集洗脱液，所述流动相为0.01-0.05MNaH2PO4溶液；7)活性炭脱色：向洗脱液中加入活性炭进行脱色，过滤后冷冻干燥，得高纯度球囊霉素相关土壤蛋白。优选地，所述柠檬酸钠溶液的浓度为50mM。优选地，用酸调节土壤提取液的pH至2.3，所述酸是稀盐酸。优选地，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.05-0.2M。优选地，所述硫酸铵的饱和度为70％。优选地，所述平衡缓冲液为10mMTris-HCl，1mMMgCl2，1mMCaCl2，0.15MNaCl，pH为8。优选地，所述凝集素特异性糖是α-甲基-D-甘露糖，其含量是0.15M。优选地，所述紫外检测的检测波长为280nm优选地，所述流动相为0.02MNaH2PO4溶液。盐析是较常用的沉淀蛋白的方法，它最大的优点是不会使蛋白质变性，当向蛋白质溶液加入无机盐时，蛋白质表面水化层会破裂而且由于离子强度的改变表面电荷会被大量中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀，本专利技术是通过加入硫酸铵形成硫酸铵饱和溶液进行蛋白质沉淀。超滤是根据分子量的差异制成相应孔隙的超滤膜，蛋白质经过超滤膜时会根据分子量进行截留，同时起到浓缩的作用。ConA凝集素亲和层析是鉴于GRSP的糖蛋白特性，由于ConA凝集素可以吸附糖蛋白从而分离目标糖组分，先用平衡缓冲液洗脱非特异性蛋白，再用含α-甲基-D-甘露糖的平衡缓冲液洗脱与凝集素结合的糖蛋白。根据GRSP的分子量特性采用分子体积排阻色谱进行纯化，其分离原理是分子量的差异，大分子先出，小分子后被洗脱下来。活性炭吸附主要是脱色的作用，吸附干扰物质腐殖酸，减少杂质干扰。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术能够从土壤中分离得到高纯度的球囊霉素相关土壤蛋白，减少了杂蛋白和腐殖酸的干扰，本专利技术还具有产物收率高，生产成本低等优点。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行详细地说明。实施例1(1)提取：称取磨细过筛的土壤样品，加入10倍重量的20mM柠檬酸钠溶液，高温加热提取1h，离心收集提取液，重复上述步骤，直至提取液为无色透明为止；(2)酸沉：向提取液中缓慢加入稀盐酸，调整pH至2，冰浴后离心收集沉淀；(3)盐析：将沉淀用0.05MNaOH溶液溶解，然后加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到80％，盐析后离心收集沉淀；(4)超滤：将盐析后的沉淀用0.05MNaOH溶液溶解，用截留分子量为30kDa的超滤膜过滤，得到超滤浓缩液；(5)层析：将ConA亲和层析柱(填料为ConASepharose4B)先用缓冲液平衡，然后上样，先用平衡缓冲液(5mMTris-HCl，0.5mMMgCl2，2mMCaCl2，0.2MNaCl，pH7.0)洗脱，再用含有0.1Mα-甲基-D-甘露糖的平衡缓冲液洗脱，收集含有α-甲基-D-甘露糖的洗脱液；(6)色谱纯化：将步骤(5)得到的洗脱液上分子体积排阻色谱柱(SECs2000，规格为300×7.8mm，5μm)，用流动相(0.01MNaH2PO4溶液)洗脱，紫外检测波长为280nm，根据出峰情况收集洗脱液；(7)活性炭脱色：向步骤(6)得到的洗脱液中加入活性炭进行脱色，过滤后冷冻干燥，即得。实施例2(1)提取：称取磨细过筛的土壤样品，加入8倍重量的50mM柠檬酸钠溶液，高温加热提取1h，离心收集提取液，重复上述步骤，直至提取液为无色透明为止；(2)酸沉：向提取液中缓慢加入0.1M稀盐酸，调整pH至2.3，冰浴后离心收集沉淀；(3)盐析：将沉淀用0.1MNaOH溶液溶解，然后加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到70％，盐析后离心收集沉淀；(4)超滤：将盐析后的沉淀用0.1MNaOH溶液溶解，用截留分子量为50kDa的超滤膜过滤，得到超滤浓缩液；(5)层析：将ConA亲和层析柱先用缓冲液平衡，然后上样，先用平衡缓冲液(10mMTris-HCl，1mMMgCl2，1mMCaCl2，0.15MNaCl，pH8.0)洗脱，再用含有0.15Mα-甲基-D-甘露糖的平衡缓冲液洗脱，收集含有α-甲基-D-甘露糖的洗脱液；(6)色谱纯化：将步骤(5)得到的洗脱液上分子体积排阻色谱柱，用流动相(0.02MNaH2PO4溶液)洗脱，紫外检测波长为280nm，根据出峰情况收集洗脱液；(7)活性炭脱色：向步骤(6)得到的洗脱液中加入活性炭进行脱色，过滤后冷冻干燥，即得。实施例3(1)提取：称取磨细过筛的土壤样品，加入6倍重量的70mM柠檬酸钠溶液，高温加热提取1h，离心收集提取液，重复上述步骤，直至提取液为无色透明为止；(2)酸沉：向提取液中缓慢加入稀盐酸，调整pH至2.5，冰浴后离心收集沉淀；(3)盐析：将沉淀用0.2MNaOH溶液溶解，然后加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到60％，盐析后离心收集沉淀；(4)超滤：将盐析后的沉淀用0.2MNaOH溶液溶解，用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤，得到超滤浓缩液；(5)层析：将ConA亲和层析柱先用缓冲液平衡，然后上样，先用平衡缓冲液(15mMTris-HCl，2mMMgCl2，0.5mMCaCl2，0.1MNaCl，pH7.5)洗脱，再用含有0.2Mα-甲基-D-甘露糖的平衡缓冲液洗脱，收集含有α-甲基-D-甘露糖的洗脱液；(6)色谱纯化：将步骤(5)得到的洗脱液上分子体积排阻色谱柱，用流动相(0.05MNaH2PO4溶液)洗脱，紫外检测波长为280nm，根据出峰情况收集洗脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种球囊霉素相关土壤蛋白的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取：将土壤样品用10‑100mM的柠檬酸钠溶液进行高温提取，收集提取液；2)酸沉：用酸调节土壤提取液的pH至2‑2.5，离心收集沉淀；3)盐析：将沉淀用氢氧化钠溶液溶解，然后向溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到50‑80％，盐析后离心收集沉淀；4)超滤：将沉淀用氢氧化钠溶液溶解，用截留分子量为30‑100kDa的超滤膜过滤，得到超滤浓缩液；5)层析：将超滤浓缩液上ConA亲和层析柱，先用平衡缓冲液洗脱，再用含有0.1‑0.2M凝集素特异性糖的平衡缓冲液洗脱并收集洗脱液，所述平衡缓冲液为5‑15mM Tris‑HCl，0.5‑2mM MgCl2，0.5‑2mM CaCl2，0.1‑0.2M NaCl，pH为7‑8；6)色谱纯化：将洗脱液上分子体积排阻色谱柱，用流动相洗脱，紫外检测，分析出峰情况并收集洗脱液，所述流动相为0.01‑0.05M NaH2PO4溶液；7)活性炭脱色：向洗脱液中加入活性炭进行脱色，过滤后冷冻干燥，得高纯度球囊霉素相关土壤蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种球囊霉素相关土壤蛋白的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取：将土壤样品用10-100mM的柠檬酸钠溶液进行高温提取，收集提取液；2)酸沉：用酸调节土壤提取液的pH至2-2.5，离心收集沉淀；3)盐析：将沉淀用氢氧化钠溶液溶解，然后向溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到50-80％，盐析后离心收集沉淀；4)超滤：将沉淀用氢氧化钠溶液溶解，用截留分子量为30-100kDa的超滤膜过滤，得到超滤浓缩液；5)层析：将超滤浓缩液上ConA亲和层析柱，先用平衡缓冲液洗脱，再用含有0.1-0.2M凝集素特异性糖的平衡缓冲液洗脱并收集洗脱液，所述平衡缓冲液为5-15mMTris-HCl，0.5-2mMMgCl2，0.5-2mMCaCl2，0.1-0.2MNaCl，pH为7-8；6)色谱纯化：将洗脱液上分子体积排阻色谱柱，用流动相洗脱，紫外检测，分析出峰情况并收集洗脱液，所述流动相为0.01-0.05MNaH2PO4溶液；7)活性炭脱色：向洗脱液中加入活性炭进行脱色，过滤后冷冻干燥，得高纯度球囊霉素相关土壤蛋白。2.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈秀华，郭雪佳，纪玲玲，马启莲，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42