一种评价RANKL靶点化合物生物学活性的体外检测工具和方法技术

本发明专利技术提供一种评价RANKL靶点化合物生物学活性的体外检测工具和方法。本发明专利技术将两种含有目的基因的质粒转入HEK293细胞（人胚胎肾细胞）中，通过药物筛选获得检测工具细胞，然后利用该工具细胞评价单抗药物体外生物学活性，与传统检测方法相比，该方法具有实验周期短、操作简便、准确度和精密度高等优点，保证了检测结果的稳定性和可靠性等优势。本发明专利技术的检测工具细胞可用于以RANKL（核因子κB受体活化因子配体）为靶点的治疗性单克隆抗体生物学活性评价、动物试验和临床试验中抗药物中和抗体（Neutralizing Antibodies）检测等。

An in vitro detection tool and method for evaluating the biological activity of RANKL target compounds

The invention provides an in vitro detection tool and method for evaluating the biological activity of RANKL target compound. The invention transfers two plasmids containing target genes into HEK293 cells (human embryonic kidney cells), obtains detection tool cells through drug screening, and then evaluates the biological activity of monoclonal antibody drugs in vitro using the tool cells. Compared with traditional detection methods, the method has the advantages of short experimental cycle, simple operation, accuracy and so on. The advantages of high precision ensure the stability and reliability of the test results. The detection tool cells of the present invention can be used for evaluating the biological activity of therapeutic monoclonal antibodies targeting at RANKL (nuclear factor kappa B receptor activating factor ligand), detecting neutralizing antibodies in animal and clinical trials, etc.

【技术实现步骤摘要】
一种评价RANKL靶点化合物生物学活性的体外检测工具和方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种评价RANKL靶点化合物体外检测的工具及方法。
技术介绍
恶性肿瘤骨转移或称转移性骨病(MetastaticBoneDiseases，MBD)是晚期肿瘤的常见疾病，是指原发于某器官的恶性肿瘤通过血液循环或淋巴系统转移到骨骼。恶性肿瘤骨转移常导致严重的骨骼病变，可大大降低肿瘤患者的生活质量，严重者会导致病情急剧恶化甚至死亡，极大地影响了患者生存期限的延长。因此，在控制原发疾病的同时，积极预防和治疗SREs(骨转移骨相关事件)在恶性肿瘤骨转移的治疗中也具有重要的临床意义。临床前研究已发现，骨转移发生是多种蛋白相互作用、涉及多条通路的复杂系统。OPG/RANKL/RANK系统是涉及破骨细胞形成、功能和存活的关键分子，RANK和其配体RANKL为重要的骨代谢调节剂。破骨细胞及其前体细胞表达的RANK与RANKL结合后，可刺激破骨细胞的形成、活化、黏附和存活，最终导致骨吸收增加。在生物治疗药物的开发过程中，基于细胞水平的生物活性检测手段是必要的，而这种检测手段还需满足以下条件：首先，该方法的实验机理与药物的体内发生作用的机理应尽可能一致，这样才能真实反应出药物在体内的疗效；其次，该方法必须能通过方法学验证，这样才能保证检测结果的真实性、准确性和可靠性；最后，该方法应尽量简单。破骨细胞的前体细胞，会在细胞表面表达RANK，RANK会被它的配体RANKL激活，进而在胞浆内招募TRAF6，激活NF-κB信号通路，加速破骨细胞前体细胞的成熟，分化成为破骨细胞。根据该原理设计细胞生物学实验，可以用来检测RANKL蛋白的生物学活性，进而检测以RANKL为靶点的单抗药物的生物学活性。传统的用于测活的细胞为RAW264.7细胞(单核巨噬细胞系)。该单核细胞在体外环境中、RANKL存在的条件下可分化为多核的破骨样细胞，并分泌表达抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-ResistantAcidPhosphatase,TRAP)。TRAP酶活性是破骨细胞的重要标志，它的活性与破骨细胞活性呈正相关。但是该传统方法实验周期较长，操作繁琐，方法准确度和精密度较差，难以保证检测结果的稳定性和可靠性。
技术实现思路
本专利技术针对以上存在的问题与不足，提供一种在治疗性RANKL靶点化合物开发过程中，在细胞水平评价药物体外生物学活性的报告基因检测方法。该方法能够满足方法验证过程中对专属性、准确性、精密度以及耐用性等方面的要求。与传统生物学活性评价方法相比，报告基因活性测定法具有操作简便、试验周期短、方法准确度和精密度较好，检测结果稳定和可靠等优点。为此，本专利技术公开了一种评价RANKL靶点化合物体外生物学活性的检测工具和方法，包括检测工具细胞的制备和检测方法的开发。本专利技术涉及一种用于检测RANKL靶点化合物生物学活性的工具细胞，所述细胞为稳定表达RANKL和NF-κB融合荧光素酶的HEK293细胞。所述细胞经过多次传代或条件变化，但表达水平仍然保持稳定。所述工具细胞的制备过程为在HEK293细胞中转入表达RANK和NF-κB融合荧光素酶的质粒，转入的两个基因可在同一个质粒上或位于两个不同质粒，所述质粒还含有编码对抗抗性药物的基因，转染后的细胞加入相对应的抗性药物进行筛选，筛选获得单克隆细胞。本专利技术所述RANKL靶点化合物选自针对RANKL靶点的单克隆抗体或其中和抗体、Fc融合蛋白、小分子化合物之一或其组合，优选为抗RANKL单抗。所述RANK基因为野生型或突变型基因，序列优选为SEQIDNo.1。所述NF-κB融合荧光素酶为全长或部分NF-κB基因融合的荧光素酶，所述荧光素酶为野生型或酶活增强的突变型，酶活增强的突变荧光素酶基因相应增强了信号放大效果，序列优选为SEQIDNo.2。所述转染方法选自电穿孔转染法、脂质体转染法或钙离子转染法。所述抗性药物选自G418、HygromycinB、Puromycin之一或其组合。所述单克隆细胞筛选方法为有限稀释法。本专利技术还涉及一种RANKL靶点化合物生物学活性的检测方法，所述方法包括如下步骤：(1)分别制备RANKL靶点化合物对照品溶液和供试品溶液，设置稀释浓度梯度；(2)培养稳定表达RANKL和NF-κB融合荧光素酶的HEK293细胞后，加入RANKL溶液，再加入步骤(1)中制备的对照品溶液和供试品溶液处理细胞；(3)用发光法萤光素酶检测试剂盒检测RANKL靶点化合物处理后细胞内所述荧光素酶水平变化，用酶标仪读取相对应的化学发光单位；(4)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以相对化学发光单位为纵坐标，得到RANKL靶点化合物的剂量效应曲线并计算供试品的生物学活性。所述梯度稀释是2～5倍稀释。所述萤光素酶检测试剂盒为LuciferaseAssaySystem。本专利技术能够快速、准确、高效的针对RANKL靶位治疗药物的生物学活性检测。该方法专属性好、特异性强、准确度高、操作简单快速，活性测定范围达到50％～150％；准确度在80.0％～120.0％范围内，重复性、日间精密度RSD均小于20％。若用此方法检测抗药物中和抗体，还具有血清耐受度高等特点。此外，本专利技术不需要昂贵的仪器和复杂的操作，完全能够满足其在检测以RANKL为靶位的单克隆抗体药物生物学活性检测及中和抗体检测。本专利技术中生物材料保藏信息如下，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏单位地址：中国武汉武汉大学保藏日期：2018.7.1保藏编号：CCTCCNO:C2018157分类命名：人胚肾293转染细胞HEK293-RANK&NF-κB-RE-luc附图说明图1针对RANKL靶位单克隆抗体生物学活性检测专属性评价具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅做示范只用。实施例1工具细胞构建中抗性药物浓度筛选将HEK293细胞(购自ATCC)铺于24孔板，细胞生长至融合度为90％时，消化细胞，取50％的细胞与不同浓度梯度的HygromycinB(20μg/ml、25μg/ml、40μg/ml、75μg/ml)和G418(200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml)混合，铺于24孔板。培养1～2周，以使细胞全部死亡所用最低HygromycinB和G418浓度为抗性筛选浓度。期间当板内细胞生长融合度达到90％左右时，按1：4的比例传代。结果表明抗性筛选药物G418、HygromycinB浓度分别为：800μg/ml、25μg/ml。实施例2工具细胞构建的构建将空白HEK293细胞传至T75瓶培养至融合度达到90％以上，收集细胞，按一定比例同时加入质粒A(自行构建)和质粒B(购自Promega公司)，250V电击30ms，24小时后将培养基换成新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)。细胞密度在转染72小本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测RANKL靶点化合物生物学活性的工具细胞，所述细胞为稳定表达RANK和NF‑κB融合荧光素酶的HEK293细胞。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测RANKL靶点化合物生物学活性的工具细胞，所述细胞为稳定表达RANK和NF-κB融合荧光素酶的HEK293细胞。2.权利要求1所述工具细胞在检测选自针对RANKL靶点的单克隆抗体或其中和抗体、Fc融合蛋白、小分子化合物之一或其组合中的应用。3.一种RANKL靶点化合物生物学活性的检测方法，所述方法包括如下步骤：（1）分别制备RANKL靶点化合物对照品溶液和供试品溶液，设置稀释浓度梯度；（2）培养稳定表达RANK和NF-κB融合荧光素酶的HEK293细胞后，加入RANKL溶液，再加入步骤（1）中制备的对照品溶液和供试品溶液处理细胞；（3）用发光法萤光素酶检测试剂盒检测抗RANKL抗体处理后细胞内所述荧光素酶水平变化，用酶标仪读取相对应的化学发光单位；（4）以稀释倍数...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁满生，方鹏，严守升，游猛，沈红，顾迎迎，朱海雯，岳会亭，刘大涛，谢宁，
申请(专利权)人：江苏泰康生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32