一种增强水性抗体制剂稳定性的方法及其应用技术

本发明专利技术针对水性抗体地舒单抗制剂组分稳定性和临床安全性的影响因素进行分析，通过在重组抗体纯化过程中降低HCP(宿主细胞蛋白)含量及其酯酶活性、消除对聚山梨酯的降解，从而增强水性抗体制剂的组分稳定性。本发明专利技术所述方法能够减少水性抗体制剂不希望的降解产物的形成、增强抗体制剂的储存稳定性。形成、增强抗体制剂的储存稳定性。形成、增强抗体制剂的储存稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种增强水性抗体制剂稳定性的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及药物制备领域，特别是一种降低单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白(HCP)含量的亲和纯化工艺方法。

技术介绍

[0002]生物医药技术是当今医药工艺发展的核心力量。以单克隆抗体类药物为典型代表的生物制品是治疗恶性肿瘤、自身免疫病以及病毒感染等疾病的重要药物种类。抗体药物生产过程中纯化工艺非常关键，发酵产物中通常含有大量杂质，其中HCP的去除最为核心。在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等基因工程细胞株大批量发酵过程中，细胞在不同的生理周期会有凋亡裂解，释放宿主细胞蛋白(Hostcell protein，HCP)。HCP是指来源于宿主细胞的蛋白成分，包括宿主细胞结构蛋白和转化蛋白(细胞分泌的促生长蛋白)。HCP不仅有可能诱导机体产生抗HCP 抗体，引起过敏反应，还有可能有“佐剂效应”引起机体对蛋白质药物产生抗体，影响药物治疗效果。
[0003]我们前期的发现微量HCP能导致药物制剂中聚山梨酯(又名：吐温)的降解。聚山梨酯，例如聚山梨酯20和80，是生物制药中常用的表面活性剂，它们可以改善蛋白质药物制剂的稳定性，并在其长期储存和运输过程中防止蛋白质产生聚集和变性，从而阻止蛋白质制剂药品质量的下降。然而聚山梨酯在一定条件下容易发生水解，造成蛋白质聚集，引起药品质量的下降。聚山梨酯的水解机理已经被行业广泛的研究，除了酸和碱的诱导水解外，残留在蛋白质制剂中微量 HCP是最主要的造成聚山梨酯水解的原因。因此蛋白药物的纯化工艺对HCP的去除提出了更高的要求。基于上述的原因，在大规模应用且经济可行的工艺条件下，开发出一种能够使HCP含量降低到1ppm以下，同时需要将导致聚山梨酯降解的一类HCP去除的纯化工艺，变得极其重要。
[0004]生产抗体药物的主要目的是为了获得纯度高的单克隆抗体分子，通过蛋白纯化方法，在提高单抗分子回收率的同时提高纯度。例如，专利CN105017418A公开的抗体纯化方法包括：1)亲和层析；2)调节亲和层析洗脱液的pH值至3.3
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3.8，进行病毒灭活；3)调节pH值至弱酸性，进行深层过滤；4)阴离子交换层析；5)阳离子交换层析。专利CN107793469A提供一种去除HCP含量的亲和纯化工艺，通过将改变淋洗步骤2的pH，通过加入氯化钠、氯化钙、盐酸精氨酸中的至少一种，作为淋洗2过程中的添加剂，降低HCP、目的蛋白及填料基质间的相互作用，从而起到去除HCP的作用。
[0005]上述现有技术均是以去除HCP、获得纯度高的抗体分子为目标，不能有效解决工业化生产中面临抗体分子纯度与回收率的矛盾。本专利技术分析了目前通用的抗体纯化工艺为Protein A亲和层析，低ph孵育与深层过滤，阴离子层析、阳离子层析，纳滤和超滤的各个步骤和具体的操作方法。对HCP的去除能力，ProteinA亲和层析和阴离子层析为基础，去除能力较强，是HCP去除的主要步骤，低 ph孵育与深层过滤能有效降低HCP中酯酶活性，阳离子层析则主要作为后续 HCP的进一步再去除工艺，纳滤和超滤对HCP的去除能力有限。本专利技术专利是在通用纯化工艺基础上，充分研究了HCP残留的生物活性以及对抗体制剂的影响，通
过优化工艺条件，调整控制参数，进一步降低HCP的含量，同时以酯酶活性为指标进行条件优化好选择消除了能够降解抗体制剂中聚山梨酯的HCP活性。

技术实现思路

[0006]为解决现有技术中以抗体纯度为指标的纯化方法难以工业化的技术问题，本专利技术针对影响水性抗体制剂组分和临床安全性的因素进行分析，通过酯酶活性和抗体纯度两个指标为依据进行方法优化和参数选择。通过在重组抗体纯化过程中去除HCP的酯酶活性、消除对聚山梨酯的降解，从而增强水性抗体制剂的组分稳定性。本专利技术所述方法能够减少水性抗体制剂不希望的降解产物的形成、增强抗体制剂的储存稳定性。
[0007]具体而言：
[0008]一方面，本专利技术提供一种增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于以含有目的抗体分子的重组细胞发酵液为对象纯化目的抗体分子的方法中，降低HCP 含量及其酯酶活性、消除其对聚山梨酯的降解。
[0009]进一步，本专利技术所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于纯化后目的抗体分子中HCP的含量不高于1ppm，HCP的酯酶活性经低pH孵育灭活。
[0010]进一步，本专利技术所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于所述纯化目的抗体分子的方法包括：具有中间洗脱步骤的亲和层析、低pH孵育灭活、阴离子交换层析、阳离子交换层析。
[0011]进一步，本专利技术所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述亲和层析过程中采用含有0.2M盐酸精氨酸的中间洗涤液。
[0012]进一步，本专利技术所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述亲和层析方法中，采用pH 6.8的柱平衡液、上样后平衡液和中间洗涤液，采用pH 3.1的洗脱液。
[0013]进一步，本专利技术所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于所述低pH 孵育灭活包括使用1M枸橼酸调节亲和层析洗脱液的pH值至3.3
‑
3.5。
[0014]进一步，本专利技术所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于所述的阴离子交换层析，其上样pH为8.0
±
0.2，Cond值为2
‑
5mS/cm，载量不超过60 mg/ml。
[0015]进一步，本专利技术所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述亲和层析方法中，
[0016]柱平衡液为：0.15M NaCl，0.02M磷酸盐缓冲液，pH 6.8；
[0017]上样后平衡液为：0.15M NaCl，0.02M磷酸盐缓冲液，pH 6.8；
[0018]中间洗涤液为：0.15M NaCl，0.02M磷酸盐，0.2M盐酸精氨酸缓冲液， pH6.8；
[0019]洗脱液为：0.0175M Na2HPO4
‑
柠檬酸缓冲液，pH3.1。
[0020]进一步，本专利技术所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述低 pH孵育灭活，在室温孵育60
‑
90min进行病毒和酯酶灭活；调pH至弱酸性 (pH5.3
‑
5.5)利用深层过滤膜包过滤去除沉淀。
[0021]进一步，本专利技术所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析方法中，
[0022]层析柱冲洗液为：0.02M Tris
‑
HCl，1M NaCl缓冲液，pH 8.0；
[0023]上样样品pH为8.0
±
0.2，Cond值为2
‑
5mS/cm，载量不超过60mg/ml。
[0024]层析柱上样后平衡液为：0.02M Tris
‑
HCl，0.04M NaCl缓冲液，pH 8.0。
[0025]另一方面，本专利技术提供增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于以含有目的抗体分子的重组细胞发酵液为对象纯化目的抗体分子的方法中，降低宿主细胞蛋白(HCP)中的酯酶活性、消除其对聚山梨酯的降解。2.如权利要求1所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于纯化后目的抗体分子中HCP的含量不高于1ppm，HCP的酯酶活性经低pH孵育灭活。3.如权利要求1所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于所述纯化目的抗体分子的方法包括：具有中间洗脱步骤的亲和层析、低pH孵育灭活、阴离子交换层析、阳离子交换层析。4.如权利要求3所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述亲和层析过程中采用含有0.2M盐酸精氨酸的中间洗涤液。5.如权利要求4所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述亲和层析方法中，采用pH 6.8的柱平衡液、上样后平衡液和中间洗涤液，采用pH 3.1的洗脱液。6.如权利要求3所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于所述低pH孵育灭活包括使用1M枸橼酸调节亲和层析洗脱液的pH值至3.3
‑
3.5。7.如权利要求3所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于所述的阴离子交换层析，其上样pH为8.0
±
0.2，Cond值为2
‑
5mS/cm，载量不超过60mg/ml。8.如权利要求5所述增强水性抗体制剂稳定性的方法，其特征在于，所述亲和层析方法中，柱平衡液为：0.15M ...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓忠，陆游，丁满生，孔苏伟，蔡如鑫，丁海峰，朱雨，代虎，
申请(专利权)人：江苏泰康生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：