双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法技术

本发明专利技术公开了一种双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法，该方法包括以下步骤：(1)油菜种子的解剖及切片；(2)油菜种子切片的尼罗红染色及DiO染色；(3)油菜种子双荧光标记切片标本制作；(4)激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描；(5)油菜种子细胞双荧光标记信号的三维重构。本发明专利技术利用双荧光标记，并具体通过对染料的具体种类及具体染色过程、后续激光共聚焦深层扫描所采用的扫描条件等进行改进及进一步优选，与现有技术相比能够有效解决油菜种子细胞或该油菜种子细胞内油滴其三维可视化处理难等问题，并且能够实现油滴和细胞体积的精准测量。

Three-dimensional visualization of single cell and oil droplets in rapeseed seeds by double fluorescence labeling

The invention discloses a method for realizing three-dimensional visualization of single cell and oil droplets of rapeseed seeds by double fluorescence labeling. The method comprises the following steps: (1) dissection and slicing of rapeseed seeds; (2) Nile red and DiO staining of rapeseed seed slices; (3) preparation of double fluorescence labeled slices of rapeseed seeds; (4) laser confocal microscopy. Dual fluorescence microscopic deep scanning; (5) Three-dimensional reconstruction of double fluorescence labeling signals in rape seed cells. The invention utilizes double fluorescent labeling, improves and further optimizes the specific dye types and dyeing process, scanning conditions adopted by subsequent laser confocal deep scanning, etc. Compared with the existing technology, it can effectively solve the three-dimensional visualization of oil droplets in rape seed cells or rape seed cells. It can deal with difficult problems and achieve accurate measurement of oil droplets and cell volume.

【技术实现步骤摘要】
双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法
本专利技术属于植物组织成像
，更具体地，涉及一种双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法，该方法通过共聚焦显微镜断层扫描技术和三维重构技术联用，利用双荧光标记能够实现油菜种子内的油滴和细胞整体三维可视化处理和相应体积的计算。
技术介绍
油菜是产油效率最高的油料作物之一，菜籽油是中国传统的食用油，是国产食用植物油的第一大来源，在我国食用油市场中具有举足轻重的地位。在此背景下，我国油菜科技工作者正在引领和推动以高油、高产、高效为目标的油菜生产的技术飞跃。在提高油菜含油量的研究中不可避免的需要掌握油菜种子内的油脂积累规律，包括油菜种子中油脂在细胞和组织内的空间分布，油滴大小和数目，油滴密度等一系列形态规律。目前，观察油菜种子内部油脂形态的主要方法有普通光学显微镜、激光共聚焦显微镜和电子透射显微镜等方法。付丽霞等(华中农业大学学报.(1993)12(6):556-560.)，韦存虚等.(中国油料作物学报(2009)31(4):445-448)，Zhi-YongHu等.(PLoSONE(2013)8(4):e62099)利用透射电镜技术观察了油菜种子中油体大小、数目、形态等指标。董劲松等(植物学报.(2009),44(1):79-85)利用激光共聚焦显微镜观察了油菜高低油种子中油体数目、形态、分布特征，得到了油菜种子细胞中油体的数量和总面积与含油量之间存在正相关的结论。JianweiGu等(Front.PlantSci.(2017),7:1989)对高低油甘蓝型油菜种子进行透射电镜观察并应用imageJ软件对油体面积进行大量统计，得到了油体大小与含油量之间的规律关系。上述研究均在二维水平对油体大小形态进行统计分析。油滴在种子内部是以近似球体或椭球体形式存在的，因此，通过切片结合二维水平的显微观察容易出现大小或形态的偏差。近年来三维成像技术在组织、细胞成像领域的应用越来越多。MartineMiquel等.(PlantPhysiology(2014)164:1866-1878)使用激光共聚焦显微镜对拟南芥种子内油滴进行深度断层扫描得到了油滴的三维立体图像，这是首次对含油种子内的油滴进行三维水平的可视化报道。但在细胞含油量计算方面，该现有技术仅能定性的判定细胞内的油滴大小，无法定量得出油滴的具体体积、以及油滴体积占细胞体积的占比。长期以来，对油菜种子的含油量的定量解析主要在宏观水平，例如，索氏提取法测定种子总的含油量，这一测定技术对于衡量一个油菜品种的含油量是准确可行且广为接受。然而，随着研究的深入和精细化的研究需求，如何探索单细胞含油量或局部组织细胞含油量的变化规律，则成为未来的研究方向之一。在测定单细胞含油量或局部组织细胞含油量的研究中，目前没有有效的研究手段，也就是说，目前无法对单细胞含油量或局部组织细胞含油量进行测定，尤其是定量测定。现有技术中所采用的透射电镜、普通光学显微镜及共聚焦显微镜等技术，目前主要在二维、单张切片的层面上进行观察而无法对单细胞含油量或局部组织细胞含油量进行定量测定。因此，在单细胞含油量或局部组织细胞含油量测定方面存在技术空白。以现有技术中MartineMiquel等.(PlantPhysiology(2014)164:1866-1878)使用激光共聚焦显微镜对拟南芥种子内油滴进行深度断层扫描得到了油滴的三维立体图像为例，这是首次对含油种子内的油滴进行三维水平的可视化报道。但该技术仍无法对单细胞的含油量进行定量测定。MartineMiquel等的研究能够观察油滴融合过程，即，小油滴随着种子发育逐渐融合成一定大小的大油滴，能够得到定性的观察结果，但对细胞内的含油量仍无法进行测定。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术的目的在于提供一种双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法，利用双荧光标记，并具体通过对染料的具体种类及具体染色过程(包括染色所采用的染色液的组分及其浓度、染色时间等)、后续激光共聚焦深层扫描所采用的扫描条件(如激发光波长、发射波长波段等)等进行改进及进一步优选，与现有技术相比能够有效解决油菜种子细胞或该油菜种子细胞内油滴其三维可视化处理难等问题，首次给出了对单细胞含油量或局部微观组织细胞含油量定量测定的方法，填补了这一技术的空白，该方法能够对油菜种子的细胞轮廓进行标记和扫描，计算细胞体积，可以实现油滴和细胞体积的精准测量。为实现上述目的，按照本专利技术，提供了一种利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的三维可视化处理或体积计算的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)油菜种子的解剖及切片选取油菜种子在解剖镜下去除种皮并保留种子胚胎；将剥离的种子胚胎分解为外子叶、内子叶及胚轴；将外子叶、内子叶及胚轴切成0.5-2mm厚的切片；(2)油菜种子切片的尼罗红染色及DiO染色将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在尼罗红染色液中染色5-10min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在DiO染色液中染色5-15min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；或者，将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在DiO染色液中染色5-15min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在尼罗红染色液中染色5-10min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；(3)油菜种子双荧光标记切片标本制作将所述步骤(2)得到的完成了双荧光染色的种子切片置于载玻片与盖玻片之间，由此制作切片标本；(4)激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描将所述步骤(3)得到的所述切片标本放到激光共聚焦显微镜下，然后打开559nm激发通道和488nm激发通道，发射波长分别为570-670nm和510-550nm；对一层细胞从一侧到另一侧进行深度扫描，扫描完成后，将扫描得到的所有图像进行保存；(5)油菜种子细胞双荧光标记信号的三维重构使用三维重构软件分别对488nm和559nm光激发通道得到的图像进行逐张信号分割并重构，由于得到所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的三维立体图像，或进一步基于积分原理计算得出所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的体积。作为本专利技术的进一步优选，所述步骤(2)中，所述尼罗红染色液中的磷酸盐缓冲液为pH为7.0-7.4的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，该尼罗红染色液中尼罗红的浓度为1mg/L；染色时间优选为10min；优选的，所述磷酸盐缓冲液为pH为7.2的0.2mol/L磷酸盐缓冲液。作为本专利技术的进一步优选，所述步骤(2)中，所述DiO染色液中的磷酸盐缓冲液为pH为7.0-7.4的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，该DiO染色液中DiO的浓度为5μmol/L；染色时间优选为10min；优选的，磷酸盐缓冲液为pH为7.2的0.2mol/L磷酸盐缓冲液。作为本专利技术的进一步优选，所述步骤(4)具体是将所述步骤(3)得到的所述切片标本放到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的三维可视化处理或体积计算的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)油菜种子的解剖及切片选取油菜种子在解剖镜下去除种皮并保留种子胚胎；将剥离的种子胚胎分解为外子叶、内子叶及胚轴；将外子叶、内子叶及胚轴切成0.5‑2mm厚的切片；(2)油菜种子切片的尼罗红染色及DiO染色将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在尼罗红染色液中染色5‑10min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3‑5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在DiO染色液中染色5‑15min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3‑5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；或者，将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在DiO染色液中染色5‑15min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3‑5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在尼罗红染色液中染色5‑10min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3‑5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；(3)油菜种子双荧光标记切片标本制作将所述步骤(2)得到的完成了双荧光染色的种子切片置于载玻片与盖玻片之间，由此制作切片标本；(4)激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描将所述步骤(3)得到的所述切片标本放到激光共聚焦显微镜下，然后打开559nm激发通道和488nm激发通道，发射波长分别为570‑670nm和510‑550nm；对一层细胞从一侧到另一侧进行深度扫描，扫描完成后，将扫描得到的所有图像进行保存；(5)油菜种子细胞双荧光标记信号的三维重构使用三维重构软件分别对488nm和559nm光激发通道得到的图像进行逐张信号分割并重构，由于得到所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的三维立体图像，或进一步基于积分原理计算得出所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的体积。...

【技术特征摘要】
1.一种利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的三维可视化处理或体积计算的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)油菜种子的解剖及切片选取油菜种子在解剖镜下去除种皮并保留种子胚胎；将剥离的种子胚胎分解为外子叶、内子叶及胚轴；将外子叶、内子叶及胚轴切成0.5-2mm厚的切片；(2)油菜种子切片的尼罗红染色及DiO染色将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在尼罗红染色液中染色5-10min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在DiO染色液中染色5-15min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；或者，将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在DiO染色液中染色5-15min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在尼罗红染色液中染色5-10min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；(3)油菜种子双荧光标记切片标本制作将所述步骤(2)得到的完成了双荧光染色的种子切片置于载玻片与盖玻片之间，由此制作切片标本；(4)激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描将所述步骤(3)得到的所述切片标本放到激光共聚焦显微镜下，然后打开559nm激发通道和488nm激发通道，发射波长分别为570-670nm和510-550nm；对一层细胞从一侧到另一侧进行深度扫描，扫描完成后，将扫描得到的所有图像进行保存；(5)油菜种子细胞双荧光标记信号的三维重构使用三维重构软件分别对488nm和559nm光激发通道得到的图像进行逐张信号分割并重构，由于得到所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的三维立体图像，或进一步基于积分原理计算得出所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的体积。2.如权利要求1所述利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的三维可视化处理或体积计算的方法，其特征在于，所述步骤(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗茂腾，尹永泰，郭祯怡，陈康，郭亮星，张凯，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42