基于长片段DNA捕获和三代测序的无创产前单体型构建方法技术

一种基于长片段DNA捕获和三代测序的无创产前单体型构建方法，包括：用孕妇和/或其丈夫外周血中的基因组DNA构建二代文库；对目标基因及侧翼区域进行捕获；构建三代上机测序文库，并进行三代测序以获得测序读长；从测序读长上目标基因的突变点向两端延伸以寻找杂合的SNP位点；不同测序读长重叠区域含有相同的一个或多个SNP位点时，该条单体型可成功向两端继续区分，直至出现存在一段区域无测序读长覆盖或测序读长检出的SNP位点都是纯合。本发明专利技术的方法实现了父母个体单体型构建，解决了目前常用依赖父母子家系单体型分析无创产前检测不适用于无法获得先证者样本家系检测的弊端。

Noninvasive prenatal haplotype construction method based on long fragment DNA capture and third generation sequencing

A noninvasive prenatal haplotype construction method based on long fragment DNA capture and three-generation sequencing, including: constructing a second-generation library with genomic DNA from the peripheral blood of pregnant women and/or their husbands; capturing target genes and flanking regions; constructing a three-generation on-board sequencing library and sequencing three generations to obtain sequencing reading length; The mutation point of the target gene extends to both ends to search for heterozygous SNP loci. When the overlapping regions of different sequencing lengths contain the same or more SNP loci, the haplotype can be distinguished from each other successfully until there is a region with unsequenced reading length coverage or SNP loci detected by sequencing reading length are homozygous. \u3002 The method of the invention realizes the construction of individual haplotype of parents, and solves the disadvantage that the non-invasive prenatal detection relying on the haplotype analysis of parents and children is not suitable for the family detection of those who can not obtain the sample of probands.

【技术实现步骤摘要】
基于长片段DNA捕获和三代测序的无创产前单体型构建方法
本专利技术涉及测序
，具体涉及一种基于长片段DNA捕获和三代测序的无创产前单体型构建方法。
技术介绍
世界卫生组织2015年出生缺陷报告显示，全球每100个新生儿就有约3个携带出生缺陷相关的基因，每年有320万出生缺陷新生儿诞生，其中27万新生儿死于出生缺陷。研究表明，绝大部分出生缺陷与遗传因素有关，单基因缺陷是重要因素之一，目前对于绝大多数单基因缺陷都没有可根治的措施，只能终生替代治疗，且存活下来的出生缺陷儿多为终生残疾或智力障碍，无法治愈，由此给社会和家庭造成了沉重的经济和心理负担。对高风险孕妇进行产前检测是一种防止出生缺陷发生的有效手段。随着孕妇外周血浆中胎儿游离DNA存在的发现，为无创产前检测胎儿基因型提供了可能。避免了由于羊水穿刺、绒毛膜取样和脐带血穿刺等有创取样方式造成流产风险及缩小需进行羊水穿刺的高危妊娠人群。传统单基因缺陷无创产前检测技术并未获得广泛应用，其原因主要是母体血浆母源基因组背景的影响，直接对单点分析所获得的胎儿母源位点遗传信息存在错误可能；血浆胎儿含量定量不准确造成假阴性；对存在假基因无法使用。家系连锁单体型信息分析是目前无创单基因缺陷检测构建父母单体型的主要技术方法。目前构建单体型的方法，多采用检测突变位点和多个与其连锁的短串联重复序列(STR)或单核苷酸多态性(SNP)来确定突变连锁单体型。STR连锁分析存在STR连锁标记位点较少的问题，具体案例中可能没有可用STR位点，需要大量预实验，且STR大多距离缺陷位点较远，无法排除重组带来错诊的可能性。基于单体型分析多采用父母先证者家系基因组捕获测序或SNP分型的方法首先获得与缺陷位点关联的单体型，多重PCR操作复杂，家系捕获测序成本较高，推广较难，且需要父母子家系样本同时获得，但是在实际应用中通常会碰上待测夫妇双方子代样本不可获得的情况，比如陆思嘉公开了“一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法”(公开号：CN105385755A)。因此，建立一种不依赖于父母子数据的单体型构建实验方法，对于进一步推广无创单基因缺陷检测技术有很重大的意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于长片段DNA捕获和三代测序的无创产前单体型构建方法，实现父母个体单体型构建。本专利技术通过如下技术方案实现：一种基于长片段DNA捕获和三代测序的无创产前单体型构建方法，包括：(1)用孕妇和/或其丈夫外周血中的基因组DNA构建用于目标区域捕获的二代文库；(2)用目标区域捕获探针对目标基因及侧翼区域进行捕获以获得捕获文库，其中上述目标基因包含突变点；(3)以上述捕获文库构建三代上机测序文库，并进行三代测序以获得测序读长；(4)在上述测序读长上，从上述目标基因的上述突变点向两端延伸以寻找杂合的SNP位点，其中一条测序读长含有多个SNP位点时，该测序读长长度即是一条单体型的长度；(5)不同测序读长重叠区域含有相同的一个或多个SNP位点时，该条单体型可成功向两端继续区分，直至出现存在一段区域无测序读长覆盖或测序读长检出的SNP位点都是纯合，最终得到与上述突变点连锁的单体型。进一步地，用于构建上述二代文库的上述基因组DNA的量是2μg以上。进一步地，上述构建用于目标区域捕获的二代文库包括如下步骤：(1a)将上述基因组DNA打断成主峰为10K附近的DNA片段；(1b)用磁珠纯化打断后的DNA片段；(1c)片段选择5K至9K范围内的DNA片段；(1d)对片段选择的DNA片段进行末端修复和3'端加A碱基；(1e)使上述DNA片段与3'端带有T碱基的二代测序接头连接；(1f)对接头连接产物进行LM-PCR预扩增，得到上述二代文库。进一步地，上述侧翼区域包括上述目标基因上下游500K区域。进一步地，上述构建三代上机测序文库包括如下步骤：(3a)对上述捕获文库进行DNA损伤修复；(3b)对上述捕获文库进行末端修复和纯化；(3c)对纯化产物进行三代测序接头连接；(3d)消化未连接的DNA片段和三代测序接头；(3e)纯化连接产物，得到上述三代上机测序文库。进一步地，上述步骤(3d)使用核酸外切酶III和核酸外切酶VII消化未连接的DNA片段和三代测序接头。进一步地，上述步骤(3e)纯化连接产物进行三次。进一步地，上述三代测序的上述目标区域平均测序深度15×以上。进一步地，上述目标区域的捕获效率大于20％。进一步地，上述三代测序采用三代单分子测序仪PacBioRSII实现。本专利技术的基于长片段DNA捕获和三代测序的无创产前单体型构建方法，实现了父母个体单体型构建，解决了目前常用依赖父母子家系单体型分析无创产前检测不适用于无法获得先证者样本家系检测的弊端；目标区域捕获测序很大程度上降低了检测成本，有利于检测推广；并且利用三代测序技术的测序读长较长，同一个测序读长包含多个SNP位点的可能性大，避免因二代捕获测序或SNP分型在特定基因上SNP数目少、距离远的问题，避免因重组事件对检测结果的影响。附图说明图1为本专利技术的无创产前单体型构建方法的一个实施方案的流程和原理示意图；图2为本专利技术的无创产前单体型构建方法的一个实施例中基因组DNA打断后Agilent2100分析结果图；图3为本专利技术的无创产前单体型构建方法的一个实施例中基因组DNA打断、片段选择后Agilent2100分析结果图；图4为本专利技术的无创产前单体型构建方法的一个实施例中LM-PCR预扩增后Agilent2100分析结果图；图5为本专利技术的无创产前单体型构建方法的一个实施例中三代上机测序文库Agilent2100分析结果图；图6为本专利技术的无创产前单体型构建方法的一个实施例中GJB2基因父亲单体型结果图；图7为本专利技术的无创产前单体型构建方法的一个实施例中GJB2基因母亲单体型结果图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本专利技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本专利技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本专利技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。图1示出了本专利技术的无创产前单体型构建方法的一个实施方案的流程和原理示意图。具体而言，包括如下步骤：(1)用孕妇和/或其丈夫外周血中的基因组DNA构建用于目标区域捕获的二代文库。具体而言：(a)从孕妇和/或孕妇丈夫外周血中抽提基因组DNA，并使用电泳及OD检测对获得的DNA进行质量检测，要求DNA无明显降解，总量在2μg以上。(b)插入片段5K二代捕获文库的构建：将2μg质量检测合格的基因组DNA利用G-tube方式打断成主峰为10K附近的DNA片段，进行两次纯化后，利用BluePippin进行片段选择(选择范围5000-9000bp)，将分选后DNA片段进行末端修复，在3'端加碱基“A”，使得DNA片段能与3'端带有“T”碱基的二代接头连接，经非捕获(Non-Captured)PCR完成二代捕获文库的构建。(2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于长片段DNA捕获和三代测序的无创产前单体型构建方法，其特征在于，包括：（1）用孕妇和/或其丈夫外周血中的基因组DNA构建用于目标区域捕获的二代文库；（2）用目标区域捕获探针对目标基因及侧翼区域进行捕获以获得捕获文库，其中所述目标基因包含突变点；（3）以所述捕获文库构建三代上机测序文库，并进行三代测序以获得测序读长；（4）在所述测序读长上，从所述目标基因的所述突变点向两端延伸以寻找杂合的SNP位点，其中一条测序读长含有多个SNP位点时，该测序读长长度即是一条单体型的长度；（5）不同测序读长重叠区域含有相同的一个或多个SNP位点时，该条单体型可成功向两端继续区分，直至出现存在一段区域无测序读长覆盖或测序读长检出的SNP位点都是纯合，最终得到与所述突变点连锁的单体型。

【技术特征摘要】
1.一种基于长片段DNA捕获和三代测序的无创产前单体型构建方法，其特征在于，包括：（1）用孕妇和/或其丈夫外周血中的基因组DNA构建用于目标区域捕获的二代文库；（2）用目标区域捕获探针对目标基因及侧翼区域进行捕获以获得捕获文库，其中所述目标基因包含突变点；（3）以所述捕获文库构建三代上机测序文库，并进行三代测序以获得测序读长；（4）在所述测序读长上，从所述目标基因的所述突变点向两端延伸以寻找杂合的SNP位点，其中一条测序读长含有多个SNP位点时，该测序读长长度即是一条单体型的长度；（5）不同测序读长重叠区域含有相同的一个或多个SNP位点时，该条单体型可成功向两端继续区分，直至出现存在一段区域无测序读长覆盖或测序读长检出的SNP位点都是纯合，最终得到与所述突变点连锁的单体型。2.根据权利要求1所述的无创产前单体型构建方法，其特征在于，用于构建所述二代文库的所述基因组DNA的量是2μg以上。3.根据权利要求1所述的无创产前单体型构建方法，其特征在于，所述构建用于目标区域捕获的二代文库包括如下步骤：（1a）将所述基因组DNA打断成主峰为10K附近的DNA片段；（1b）用磁珠纯化打断后的DNA片段；（1c）片段选择5K至9K范围内的DNA片段；（1d）对片段选择的DNA片段进行末端修复和3'端加A碱基；（1e...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈超，王垚燊，郭凤禹，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，天津华大医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44