本发明专利技术提供了一种扩增螟蛾科昆虫线粒体基因组的试剂盒，该试剂盒包含两对引物，其序列如SEQ ID NO:1‑4所示，并提供了所述通用引物在螟蛾科线粒体基因组测序中的应用。采用本发明专利技术的通用引物可以准确快速的扩增出多种螟蛾科昆虫的线粒体基因组长片段，有助于螟蛾科系统发育及种群遗传结构的研究。
【技术实现步骤摘要】
一种扩增螟蛾科昆虫线粒体基因组的试剂盒及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种扩增螟蛾科昆虫线粒体基因组的试剂盒及其应用。
技术介绍
螟蛾总科，包括草螟科和螟蛾科，螟蛾总科昆虫通称为螟蛾。目前，全世界己被描述的螟蛾至少有15576种，我国记录约两千余种。大多数螟蛾总科昆虫都是农林及仓储害虫，特别是钻蛀类螟蛾，常见的有二化螟(Chilosuppressalis)、三化螟(Scirpophagaincertulas)、稻纵卷叶野螟(Cnaphalocrocismedinalis)、豆荚野螟(Marucavitrata)、等，其分布范围广，种类丰富，大面积的虫害给农林业造成严重的经济损失，因此防治螟蛾类昆虫具有十分重要的经济意义。近年来，鳞翅目全线粒体基因组序列的测定得到了快速的发展，Genbank中己释放的鳞翅目昆虫线粒体基因序列己从几条增加至三百多条。目前，全线粒体基因组测序已被广泛应用于在整个鳞翅目的不同总科、科、亚科、属、种间的系统发育分析，并辅助分析一些难以通过传统分类手段确定其归属的物种，帮助其确定分类阶元。目前，昆虫遗传研究过程中，小规模线粒体基因组研究的主流方法仍然是传统的基于PCR扩增产物的引物步移法。该方法使用的引物数量较多、扩增效率低、对模版纯度要求高、耗时长，并且缺少足够的特异性，这将阻碍昆虫线粒体基因组分子数据的快速积累，并对某些昆虫如对螟蛾科昆虫的系统发育研究造成困难。而现有技术中也不存在有专门针对螟蛾科昆虫线粒体基因组长片段扩增的通用引物的研究与报道。
技术实现思路
鉴于克服以上技术问题，本专利技术提供一种扩增螟蛾科昆虫线粒体基因组长片段的通用引物，该引物可以对螟蛾科昆虫线粒体基因组长片段进行高特异性扩增。本专利技术还提供了采用所述引物进行LA-PCR方法，以及所述通用引物在螟蛾科昆虫系统发育分析及基因组测序中的应用。一方面，本专利技术提供了一种扩增螟蛾科昆虫线粒体基因组的试剂盒，所述的试剂盒包含两对引物，引物序列如SEQIDNO:1-4所示，F1(上游引物)：5’-CGTATAAWGTATGGKTATGCCTGATTTAGCGG-3’(SEQIDNO:1),R1(下游引物)：5’-TGAAYCGTTGCGCTAGCTAGGGTACCKTGA-3’(SEQIDNO:2)，F2(上游引物)：5’-TGACGTTTGCCWAACGGACTTGACTTTACGG-3’(SEQIDNO:3),R2(下游引物)：5’-GCCTAAACTTTGGGCTAACGTGCYTACCTAGG-3’(SEQIDNO:4)，引物碱基兼并代码：W＝A/TK＝G/CY＝C/T；另一方面，本专利技术提供了一种对螟蛾科昆虫线粒体基因组进行高特异性扩增的方法，以螟蛾科昆虫基因组DNA为模板，采用所述的引物进行LA-PCR扩增；其中，所述的LA-PCR扩增中，PCR扩增体系为25μl，其中包括5μlMg2+的10×buffer，2.5μl浓度为2.5mM的dNTP，3μl浓度为10μmol的上游引物，3μl浓度为10μmol的下游引物，0.2μl浓度为5U/μlrTaq酶，1μlDNA模板，余量为无菌蒸馏水。其中，扩增程序为：93℃预变性1min，92℃变性8s、45℃-55℃退火90s、72℃延伸1min、共35循环，72℃延伸6min，4℃保存。另一方面，本专利技术还提供了所述试剂盒在在螟蛾科昆虫系统发育分析及基因组测序中的应用。有益效果：采用本专利技术的试剂盒可以高特异性扩增出螟蛾科不同属、种的线粒体基因组的长片段序列，相对于现有技术中的普通PCR引物而言，其扩增产物保真性高，特异性强，有效缩短分子数据的获取周期，有助于对螟蛾科或鳞翅目昆虫的系统发育和种群遗传结构的分析研究。附图说明图1本专利技术的引物对螟蛾科5种昆虫线粒体基因组长片段的扩增效果图。1-2为褐巢螟，3-4为三化螟，5-6为稻纵卷叶野螟，7-8为橙黑纹野螟，9-10为二化螟，M为Maker。图2实验过程中其它引物对螟蛾科5种昆虫线粒体长片段的扩增效果图。1-2为褐巢螟，3-4为三化螟，5-6为稻纵卷叶野螟，7-8为橙黑纹野螟，9-10为二化螟，M为Maker。具体实施方式下面用实施例来进一步说明本专利技术，但本专利技术并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：引物的设计1.以Genbank中测得的不同螟蛾科昆虫的线粒体基因组序列为基础，数据来源于美国国立生物技术信息中心(NCBI,http:/www.ncbi.nlm.gov/)；2.利用ClustalX软件将不同螟蛾科昆虫的线粒体基因组全序列进行比对，找出比较保守、碱基变异度最小的序列区域；其中采用的螟蛾科昆虫的线粒体基因组全序列数据(部分代表种)如表1所示。表1本专利技术采用线粒体基因组全序列数据来源(部分)分类地位种登录号斑螟亚科Phycitinae地中海粉螟EhestiakuehniellaNC_022476蜡螟亚科Galleriinae米螟CorcyracephalonicaNC_016866螟蛾亚科Pyralinae褐巢螟HypsopygiareginaNC_030508薄翅螟亚科Evergestinae双斑薄翅螟EvergestisjunctalisNC_030509水螟亚科Acentropinae棉塘水螟ElophilainterruptaltsNC_021756禾螟亚科Schoenobiinae三化螟ScirpophagaincertulasNC_021413斑野螟亚科Spilomelinae稻纵卷叶野螟CnaphalocrocismedinalisNC_022669斑野螟亚科Spilomelinae橙黑纹野螟TspanodesstriataNC_030510野螟亚科Pyraustinae欧洲玉米螟OstrinianubilalisNC_003367草螟亚科Crambinae二化螟ChilosuppressalisNC_015612草螟亚科Crambinae黄纹野草螟PseudargyriainterruptellaNC_0297513.根据上述的比对结果，利用引物设计软件PrimerPremier5在碱基变异度最小的序列区域设计出2对引物，F1(上游引物)：5’-CGTATAAWGTATGGKTATGCCTGATTTAGCGG-3’(SEQIDNO:1),R1(下游引物)：5’-TGAAYCGTTGCGCTAGCTAGGGTACCKTGA-3’(SEQIDNO:2)，F2(上游引物)：5’-TGACGTTTGCCWAACGGACTTGACTTTACGG-3’(SEQIDNO:3),R2(下游引物)：5’-GCCTAAACTTTGGGCTAACGTGCYTACCTAGG-3’(SEQIDNO:4)，引物碱基兼并代码：W＝A/TK＝G/CY＝C/T。实施例2昆虫总基因组DNA的提取与检测1.材料处理:分别取褐巢螟、三化螟、稻纵卷叶野螟、橙黑纹野螟、二化螟死亡的成虫用蒸馏水冲洗，将其按头、胸、足分为3部分，分别置于离心管中。2.裂解液配制:按照每个离心管400μl配制足量的裂解液(加20μl的蛋白酶K)。3.样品研磨:分别加裂解液200μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种扩增螟蛾科昆虫线粒体基因组的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含两对引物，其序列如SEQ ID NO:1‑4所示。
【技术特征摘要】
1.一种扩增螟蛾科昆虫线粒体基因组的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含两对引物，其序列如SEQIDNO:1-4所示。2.一种采用权利要求1所述的试剂盒扩增螟蛾科昆虫线粒体基因组的方法，其特征在于，以螟蛾科昆虫基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物进行LA-PCR扩增。3.根据权利要求2所述的扩增螟蛾科昆虫线粒体基因组的方法，其特征在于，所述的LA-PCR扩增中，PCR扩增体系为25μl，其中包括5μlMg2+的10×buffer，2.5μl浓度为2.5mM的dNTP，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李飞，赵蕊，
申请(专利权)人：杭州贝英福生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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