一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法技术

一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：(1)将液氮中保存的番石榴叶片加入磷酸缓冲液中，再加无菌石英砂和玻璃珠，震荡后超声处理，离心得到含叶际微生物的混合液；(2)向含叶际微生物的混合液再加TENP溶液，反复冻融处理后，加入溶菌酶和蛋白酶K，水浴，再加入SDS缓冲液，水浴，离心处理后得到沉淀a与上清液a；(3)向上清液a中加入氯仿与异戊醇，离心得到沉淀b与上清液b；(4)向上清液b中加入PEG8000沉淀剂，冷冻保存后离心得到沉淀c与上清液c；(5)将沉淀c用乙醇洗涤，离心冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA。本发明专利技术方法简单、提取率高，具有广阔的市场应用前景。

A Method for Extracting Genomic DNA from Psidium guava Interfoliar Microorganisms

A method for extracting genomic DNA of guava interfoliar microorganisms includes the following steps: (1) adding guava leaves preserved in liquid nitrogen into phosphate buffer solution, adding sterile quartz sand and glass beads, after shaking, ultrasonic treatment, centrifugation to obtain a mixture containing interfoliar microorganisms; (2) adding TENP to the mixture containing interfoliar microorganisms. After repeated freeze-thaw treatment, lysozyme and protease K were added, water bath was added, SDS buffer was added, water bath was added, and centrifugation treatment was used to obtain precipitation a and supernatant a; (3) chloroform and isoamyl alcohol were added to supernatant a, and precipitation B and supernatant B were obtained by centrifugation; (4) PEG8000 was added to supernatant b, which was centrifuged after cryopreservation. To precipitate C and supernatant c; (5) The precipitate C was washed with ethanol and centrifugally freeze-dried to obtain genomic DNA of guava interfoliar microorganisms. The method of the invention is simple and has high extraction rate, and has broad market application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种植物叶际微生物基因组DNA的提取方法。
技术介绍
植物地上部分(包括叶、茎、花、果等)作为一个独立的微环境，其表面和内部通常栖息着大量的各种类型的微生物。这种植物的地上部分称为叶际(phyllosphere)，这些在叶际上生存并可以定居和增殖的微生物群体称为叶际微生物(epiphytes)。长期以来，对植物叶际微生物的研究主要是集中在植物病原微生物的行为和控制方面，很多植物病原菌已经得到纯培养，也有许多专性寄生的病原菌在活体植物上得到了保存。但是对植物叶际微生物的研究远远落后于植物根际微生物，对那些尚未培养的微生物以及非病原叶际微生物的特性了解甚少。近年来的研究表明，叶际微生物中不仅有阻碍植物生长、发育的病原微生物，还有相当一部分的非病源微生物，它们起着重要的生态功能。如：促进植物的生长发育、抵御病害微生物、改变植物表面特性、生物固氮、降解有机污染物等。发挥这些重要作用的基础是这些叶际微生物产生的丰富多样的次生代谢产物，它们具有多种生物活性，在农业、环保和医药业中具有重要的应用潜力。鉴于此，有关植物叶际微生物的研究引起了世界上许多国家的重视。高质量的DNA是分子生物学关键的一步，是进行分子标记、基因组文库构建、亲缘关系分析等分子生物学研究的基础。植物叶际微生物DNA提取的方法多种多样，针对不同植物材料的特点，高质量DNA提取的方法也不尽相同。番石榴属桃金娘科番石榴属植物。番石榴果形状有球形、椭圆、卵圆形及洋梨形，果皮普通为绿色、红色、黄色，果肉有白色、红色、黄色等，其肉质非常柔软，肉汁丰富，味道甜美，可溶性固形物含量为8％-11％，富含大量的钾、铁、胡萝卜素等物质，营养极其丰富，是养颜美容、减肥的最佳水果。其果实不但可以鲜食，还可以加工为果汁、果酱、果脯，同时还可制作成盆景，具有广阔的市场前景，是目前港澳台和东南亚地区最畅销的水果之一。另外，番石榴叶片和幼果切片晒干泡茶喝，可辅助治疗糖尿病。因此，提供一种简单、有效的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，对番石榴叶际微生物分子生物学方面的研究具有非常大的帮助。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供简单、提取高的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：(1)将液氮中保存的番石榴叶片加入磷酸缓冲液中，再加无菌石英砂和玻璃珠(粒径为1-4mm)，在可调漩涡混匀器上震荡，高强度漩涡震荡后进行超声处理后，离心去除番石榴叶片后得到含叶际微生物的混合液；(2)向步骤(1)中得到的含叶际微生物的混合液再加TENP溶液，反复冻融处理后，加入溶菌酶和蛋白酶K，水浴，再加入SDS缓冲液，水浴，离心处理后得到沉淀a与上清液a；SDS缓冲液的作用在于破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来；(3)在步骤(2)中得到的上清液a中加入氯仿与异戊醇的混合溶液，静置后离心得到沉淀b与上清液b；氯仿与异戊醇的混合溶液的作用在于去除蛋白质等物质；(4)在步骤(3)中得到的上清液b中加入PEG8000沉淀剂，冷冻保存后离心得到沉淀c与上清液c；PEG8000沉淀剂可与DNA发生共沉淀作用，可以得到纯化DNA；冷冻保存更利于沉淀c与上清液c的分离；(5)将步骤(4)中得到的沉淀c用乙醇洗涤，离心冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA；乙醇用于对DNA进行漂洗，使残留杂质溶于乙醇，以进一步净化DNA。上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，将步骤(2)中得到的沉淀a代替步骤(2)中的含叶际微生物的混合液再重复步骤(2)至少一次。重复步骤(2)至少一次有利于更多的溶出更多的叶际微生物的DNA。上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述磷酸缓冲液的成分包括：137mmoL/LNaCl，10mmoL/LNa2HPO4，2mmoL/LKH2PO4，所述磷酸缓冲液的pH为7.4；所述磷酸缓冲液的加入量控制为每4-5g番石榴叶片加入磷酸缓冲液9-10mL。上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述步骤(1)中，番石榴叶片、石英砂、玻璃珠的质量比为4-5：0.5-1：0.4-0.6。采用上述比例的番石榴叶、石英砂与无菌玻璃珠更加有利于将叶片表面的叶际微生物震荡洗脱下来。上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述TENP溶液的成分包括：50mMTris，20mMEDTA，100mMNaCl，0.01g/mLPVP，所述TENP溶液的pH为10；所述TENP溶液的加入量控制为每4-5g番石榴叶片加入TENP溶液250-360uL(更优选的为300uL)。上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述冻融处理的条件为：于-20℃下处理18min，再于45℃下处理5min，所述冻融处理的次数不少于3次。反复冻融处理利于叶际微生物破壁，叶际微生物DNA的提取率更高。上述冻融处理的工艺参数利于叶际微生物的充分破壁，可提升最终叶际微生物提取量。上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述溶菌酶和蛋白酶K的加入量控制为每4-5g番石榴叶片加入8-12uL100mg/mL的溶菌酶和蛋白酶K。上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述SDS缓冲液的成分包括：100mmoL/LTris，100mmoL/LEDTA-2Na，200mmoL/LNaCl，体积分数为2％PVP，体积分数为2％CTAB，所述SDS缓冲液的pH为8。上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述氯仿与异戊醇的混合溶液中氯仿与异戊醇的体积比为23-25：1，所述氯仿与异戊醇的混合溶液的加入量为所述上清液a体积的0.8-1.2倍。上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述PEG8000沉淀剂的成分包括：体积分数为13％PEG8000，1.6moL/LNaCl，所述PEG8000沉淀剂的加入量为所述上清液b体积的0.8-1.2倍。上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述冷冻保存的温度为-80℃，时间为28-33min。本专利技术中采用微珠法+超声法+反复冻融法+化学法(破壁酶)相结合的方法，对番石榴叶片的叶际微生物进行洗脱与破壁，上述各步骤之间相互协同作用，可以最大限度的将叶际微生物洗脱下来，并充分破壁，可以大大提升最终叶际微生物基因组DNA的提取量。上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述番石榴叶际微生物基因组DNA的浓度检测方法包括以下步骤：将DNA样品稀释后，用紫外分光光度计测定OD260和OD280值，按照1个OD260值相当于50ng/μL和稀释倍数来计算DNA的浓度。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1、本专利技术在将番石榴叶片上的叶际微生物分离时，采用石英砂与无菌玻璃珠的联用更加有利于将叶片表面的叶际微生物震荡洗脱下来，并采用冻融处理与酶法处理二者联合对叶际微生物进行破壁处理，最终得到的叶际微生物的DNA的提取率高。2、本专利技术的提取方法操作步骤简单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将液氮中保存的番石榴叶片加入磷酸缓冲液中，再加无菌石英砂和玻璃珠，在可调漩涡混匀器上震荡，高强度漩涡震荡后进行超声处理后，离心去除番石榴叶片后得到含叶际微生物的混合液；(2)向步骤(1)中得到的含叶际微生物的混合液再加TENP溶液，反复冻融处理后，加入溶菌酶和蛋白酶K，水浴，再加入SDS缓冲液，水浴，离心处理后得到沉淀a与上清液a；(3)在步骤(2)中得到的上清液a中加入氯仿与异戊醇的混合溶液，静置后离心得到沉淀b与上清液b；(4)在步骤(3)中得到的上清液b中加入PEG8000沉淀剂，冷冻保存后离心得到沉淀c与上清液c；(5)将步骤(4)中得到的沉淀c用乙醇洗涤，离心冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA。

【技术特征摘要】
1.一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将液氮中保存的番石榴叶片加入磷酸缓冲液中，再加无菌石英砂和玻璃珠，在可调漩涡混匀器上震荡，高强度漩涡震荡后进行超声处理后，离心去除番石榴叶片后得到含叶际微生物的混合液；(2)向步骤(1)中得到的含叶际微生物的混合液再加TENP溶液，反复冻融处理后，加入溶菌酶和蛋白酶K，水浴，再加入SDS缓冲液，水浴，离心处理后得到沉淀a与上清液a；(3)在步骤(2)中得到的上清液a中加入氯仿与异戊醇的混合溶液，静置后离心得到沉淀b与上清液b；(4)在步骤(3)中得到的上清液b中加入PEG8000沉淀剂，冷冻保存后离心得到沉淀c与上清液c；(5)将步骤(4)中得到的沉淀c用乙醇洗涤，离心冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA。2.根据权利要求1所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，将步骤(2)中得到的沉淀a代替步骤(2)中的含叶际微生物的混合液再重复步骤(2)至少一次。3.根据权利要求1或2所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的成分包括：137mmoL/LNaCl，10mmoL/LNa2HPO4，2mmoL/LKH2PO4，所述磷酸缓冲液的pH为7.4；所述磷酸缓冲液的加入量控制为每4-5g番石榴叶片加入磷酸缓冲液9-10mL。4.根据权利要求1或2所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，番石榴叶片、石英砂、玻璃珠的质量比为4-5：0.5-1：0.4-0.6。5.根据权利要求1或2所述的番石榴叶际...

【专利技术属性】
技术研发人员：申丽，谢志国，曾伟民，周智广，吴学玲，李交昆，余润兰，刘元东，胡芳，王俊俊，邱冠周，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43