一种克隆未知基因的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种克隆未知基因的方法及其应用，包括如下步骤：S1：蛋白质序列测定及数据分析；S2：将上述蛋白电泳所得的蛋白条带取样，将取样的蛋白条放入检测设备中进行二级质谱分析；S3：预测蛋白质序列数据汇总整理。本发明专利技术确保了产品性能的稳定，提高了效率，稳定性高，降低了生产和应用的成本，促进了益生菌的大面积推广使用，通过获知控制拮抗菌拮抗活性成分的基因，并通过分子生物学手段对该基因进行克隆，获得工程菌株，进而通过发酵工程技术批量生产该菌株，对该基因进行高通量表达，最终为生产提供稳定、高产、高效的微生物制剂。

A Method of Cloning Unknown Genes and Its Application

The invention discloses a method for cloning unknown genes and its application, including the following steps: S1: protein sequencing and data analysis; S2: protein bands obtained by electrophoresis of the above-mentioned proteins are sampled, and the sampled protein strips are put into the detection equipment for secondary mass spectrometry analysis; S3: data aggregation of predicted protein sequences Li. The invention ensures the stability of product performance, improves efficiency and stability, reduces the cost of production and application, promotes the large-scale popularization and use of probiotics, obtains the genes controlling antagonistic active ingredients of antagonistic bacteria, clones the genes by means of molecular biology, obtains the engineering strains, and then obtains the engineering strains. The strain was produced in batches by fermentation engineering technology, and the gene was expressed in high throughput. Finally, stable, high-yield and high-efficiency microbial preparations were provided for production.

【技术实现步骤摘要】
一种克隆未知基因的方法及其应用
本专利技术涉及克隆未知基因
，具体为一种克隆未知基因的方法及其应用。
技术介绍
基因工程的上游工程主要是目的基因的制取和无性繁殖。具体地说是从生物体的组织、器官或细胞制取目的基因或者人工合成目的基因，将目的基因与载体的DNA拼接，使重组体分子导入受体细胞，筛选和进行无性繁殖。这个过程可以称为基因克隆。基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制。基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。目前生产上已有不少益生菌在示范推广中，但显现出的突出问题一是产品性能不稳定，二是有效成分比例偏低，三是生产和应用成本较高，严重限制了益生菌的大面积推广使用。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种克隆未知基因的方法及其应用，解决了上述
技术介绍
中所提出的问题。(二)技术方案为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种克隆未知基因的方法，包括如下步骤：S1：蛋白质序列测定及数据分析；S2：将上述蛋白电泳所得的蛋白条带取样，将取样的蛋白条放入检测设备中进行二级质谱分析；S3：预测蛋白质序列数据汇总整理：①根据测序反馈回来的蛋白质信息，进行分析，首先将不同数据库中的蛋白质分别整理，每个数据库中每个样品的，每种蛋白质名称、分子量大小等电点、肽段数和序列号等各种原始数据分类归纳到一起。②将所有数据库的数据放在一起整理，将相同蛋白质的整理在一起，比较相同蛋白质的菌株来源和分子量以及肽段数等的区别。③将相同的蛋白质归为一组，整理蛋白质与菌株。S4：预测蛋白的分组及氨基酸序列数据库的建立：根据上述整理出来的预测蛋白质的数据，通过每种蛋白不同菌株来源的序列号进入相应的数据库中进行氨基酸序列的搜索查询，并下载每种蛋白质的氨基酸信息，保存在单独的文本文档并命名以建立个人蛋白质数据库。S5：引物设计：1)用VectorNTIAdvance11软件对氨基酸序列进行比对，将同源性较高的归为一组。2)根据每组蛋白N端和C端的同源性，各取7个氨基酸序列，查对遗传密码子表，将氨基酸序列转化为对应的核酸序列，以基因头尾固定的方式手动设计引物，同时考虑氨基酸的兼并性、酶切位点及其保护碱基。3)引物合成。S6：目的基因扩增及测序：以研究菌株总DNA为模板，以下列反应程序和体系扩增目的基因(目的基因被命名为an04)，进而T-克隆。PCR反应程序：PCR体系：S7：目的基因扩增(1)酶连PCR产物按TakaraT4DNALigase使用说明书操作，将目的基因与T-载体连接。(2)转化常规化学转化法转化E.coliTop10。(3)测序。S8：目的基因克隆：将目的基因与表达载体pET15b连接，用常规化学转化法转入表达宿主E.coliBL21(DE3)plysS。S9：目的基因的诱导及抑菌活性检测：三区划线E.coliBL21(DE3)plysS/pET15b-目的基因，挑取单菌落接种到5mLLB液体培养基中，通过37℃摇床培养，室内放置10h，放置10h后按照1:100的比例转接到1000mLLB培养基中进行扩大培养至A600到0.8～1.0，随后加入0.16mMIPTG(0.8MIPTG200μL/L)，并在25℃下诱导10h。抑菌活性检测：以哈维氏弧菌为指示菌，检测克隆基因表达产物的拮抗性能，采用打孔法，具体操作如下：用移液枪吸取1μL过夜培养的哈维氏弧菌发酵液，加入99μL无菌水，稀释为1％，均匀涂布到LB平板上，用无菌黄色枪头大头在培养基上打孔，孔中添加50μL拮抗菌，至拮抗菌完全渗入培养基后28℃培养，9h后观察抑菌活性。S10：克隆基因诱导表达产物分子量分析，常规蛋白电泳技术，检测方法7诱导表达产物的分子量。S11：得出结论：1、抗菌肽电泳：可抑制哈维氏弧菌生长的拮抗菌BACILLUSPUMILUSE14-3，其发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE离子交换分离，具有拮抗作用的成分经蛋白电泳。分子量在25kD以下，和前期研究中质谱分析结果21kD一致。2、蛋白质测序及数据分析，将条带取样，条带标注为1，2，3，进行二级质谱分析，预测蛋白质组成及氨基酸序列，根据预测蛋白序列结果，留取蛋白质可信度在85％以上的蛋白质并归类，35个菌株8种不同类型的蛋白质，将来自不同菌株、分子量在21kD左右的蛋白Phosphoheptoseisomerase，在相应数据库中下载对应蛋白质的氨基酸序列信息，由此获得PhosphoheptoseisomeraseN端和C端氨基酸序列分别为MYHDLIR和EKEMVKA。3、引物设计通过预测蛋白质Phosphoheptoseisomerase的首尾氨基酸序列，设计引物，命名为SW-06F&SW-06R，其序列如下：SW-06FGCTCTAGAATGTAYCATGAYCTNATHCGNSW-06RCGGGATCCRGCYTTRACCATYTCYTTYTC4、目的基因扩增以哈维氏弧菌拮抗菌株BACILLUSPUMILUSE14-3总DNA为模板，按方法4进行PCR扩增并与及T-载体连接：GCTCTAGAATGTATCATGATCTCATACGTAGTGAACTGAACGAAGCGGCCGATACCCTGGCGAAATTTATCAATGACGATGCCAATATCGACGCCATTCAACGCGCGGCAGTGCTGCTGGCCGACTCCTTCAAAGCCGGCGGGAAAGTCATTTCCTGCGGTAACGGTGGCTCCCACTGTGACGCCATGCATTTTGCCGAAGAGCTGACCGGCCGCTACCGTGAAAACCGCCCAGGCTATCCGGCGATTGCCATTTCCGACGTTAGCCACCTGTCTTGCGTCAGCAACGACTTCGGCTACGAGTATGTGTTTTCGCGCTATGTGGAAGCGGTAGGCCGCGAAGGCGACGTACTGCTGGGCATTTCCACCTCAGGCAACTCCGGCAACATCATTAAAGCTATCGAAGCGGCGCGTGCCAAAGGGATGAAAGTGATCACCCTGACCGGCAAAGACGGCGGCAAAATGGCCGGTTCCGCAGACGTGGAAATCCGCGTACCGCACTTCGGTTACGCCGATCGCATCCAGGAAATTCATATCAAAGCGATCCACATCTTGATTCAGCTGATCGAGAAAGAGATGGTCAAAGCCGGATCCCGA5、目的基因克隆根据T-测序结果，两端添加酶切位点NdeI/BamHI，连入pET15b，转化E.coliTop10，得E.coliTop10/pET15b-an04，目的基因序列如下：CATATGTATC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种克隆未知基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：蛋白质序列测定及数据分析；S2：将上述蛋白电泳所得的蛋白条带取样，将取样的蛋白条放入检测设备中进行二级质谱分析；S3：预测蛋白质序列数据汇总整理：①根据测序反馈回来的蛋白质信息，进行分析，首先将不同数据库中的蛋白质分别整理，每个数据库中每个样品的，每种蛋白质名称、分子量大小等电点、肽段数和序列号等各种原始数据分类归纳到一起。②将所有数据库的数据放在一起整理，将相同蛋白质的整理在一起，比较相同蛋白质的菌株来源和分子量以及肽段数等的区别。③将相同的蛋白质归为一组，整理蛋白质与菌株。S4：预测蛋白的分组及氨基酸序列数据库的建立：根据上述整理出来的预测蛋白质的数据，通过每种蛋白不同菌株来源的序列号进入相应的数据库中进行氨基酸序列的搜索查询，并下载每种蛋白质的氨基酸信息，保存在单独的文本文档并命名以建立个人蛋白质数据库。S5：引物设计：1)用Vector NTI Advance 11软件对氨基酸序列进行比对，将同源性较高的归为一组。2)根据每组蛋白N端和C端的同源性，各取7个氨基酸序列，查对遗传密码子表，将氨基酸序列转化为对应的核酸序列，以基因头尾固定的方式手动设计引物，同时考虑氨基酸的兼并性、酶切位点及其保护碱基。3)引物合成。S6：目的基因扩增及测序：以研究菌株总DNA为模板，以下列反应程序和体系扩增目的基因(目的基因被命名为an04)，进而T‑克隆。PCR反应程序：...

【技术特征摘要】
1.一种克隆未知基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：蛋白质序列测定及数据分析；S2：将上述蛋白电泳所得的蛋白条带取样，将取样的蛋白条放入检测设备中进行二级质谱分析；S3：预测蛋白质序列数据汇总整理：①根据测序反馈回来的蛋白质信息，进行分析，首先将不同数据库中的蛋白质分别整理，每个数据库中每个样品的，每种蛋白质名称、分子量大小等电点、肽段数和序列号等各种原始数据分类归纳到一起。②将所有数据库的数据放在一起整理，将相同蛋白质的整理在一起，比较相同蛋白质的菌株来源和分子量以及肽段数等的区别。③将相同的蛋白质归为一组，整理蛋白质与菌株。S4：预测蛋白的分组及氨基酸序列数据库的建立：根据上述整理出来的预测蛋白质的数据，通过每种蛋白不同菌株来源的序列号进入相应的数据库中进行氨基酸序列的搜索查询，并下载每种蛋白质的氨基酸信息，保存在单独的文本文档并命名以建立个人蛋白质数据库。S5：引物设计：1)用VectorNTIAdvance11软件对氨基酸序列进行比对，将同源性较高的归为一组。2)根据每组蛋白N端和C端的同源性，各取7个氨基酸序列，查对遗传密码子表，将氨基酸序列转化为对应的核酸序列，以基因头尾固定的方式手动设计引物，同时考虑氨基酸的兼并性、酶切位点及其保护碱基。3)引物合成。S6：目的基因扩增及测序：以研究菌株总DNA为模板，以下列反应程序和体系扩增目的基因(目的基因被命名为an04)，进而T-克隆。PCR反应程序：PCR体系：S7：目的基因扩增(1)酶连PCR产物按TakaraT4DNALigase使用说明书操作，将目的基因与T-载体连接。(2)转化常规化学转化法转化E.coliTop10。(3)测序。S8：目的基因克隆：将目的基因与表达载体pET15b连接，用常规化学转化法转入表达宿主E.coliBL21(DE3)plysS。S9：目的基因的诱导及抑菌活性检测：三区划线E.coliBL21(DE3)plysS/pET15b-目的基因，挑取单菌落接种到5mLLB液体培养基中，通过37℃摇床培养，室内放置10h，放置10h后按照1:100的比例转接到1000mLLB培养基中进行扩大培养至A600到0.8～1.0，随后加入0.16mMIPTG(0.8MIPTG200μL/L)，并在25℃下诱导10h。抑菌活性检测：以哈维氏弧菌为指示菌，检测克隆基因表达产物的拮抗性能，采用打孔法，具体操作如下：用移液枪吸取1μL过夜培养的哈维氏弧菌发酵液，加入99μL无菌水，稀释为1％，均匀涂布到LB平板上，用无菌黄色枪头大头在培养基上打孔，孔中添加50μL拮抗菌，至拮抗菌完全渗入培养基后28℃培养，9h后观察抑菌活性。S10：克隆基因诱导表达产物分子量分析，常规蛋白电泳技术，检测方法7诱导表达产物的分子量。S11：得出结论：1、抗菌肽电泳：可抑制哈维氏弧菌生长的拮抗菌BACILLUSPUMILUSE14-3，其发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE离子交换分离，具有拮抗作用的成分经蛋白电泳。分子量在25kD以下，和前期研究中质谱分析结果21kD一致。2、蛋白质测序及数据分析，将条带取样，条带标注为1，2，3，进行二级质谱分析，预测蛋白质组成及氨基酸序列，根据预测蛋白序列结果，留取蛋白质可信度在85％以上的蛋白质并归类，35个菌株8种不同类型的蛋白质，将来自不同菌株、分子量在21kD左右的蛋白Phosphoheptoseisomerase，在相应数据库中下载对应蛋白质的氨基酸序列信息，由此获得PhosphoheptoseisomeraseN端和C端氨基酸序列分别为MYHDLIR和EKEMVKA。3、引物设计通过预测蛋白质Phosphoheptoseisomerase的首尾氨基酸序列，设计引物，命名为SW-06F&SW-06R，其序列如下：SW-06FGCTCTAGAATGTAYCATGAYCTNATHCGNSW-06RCGGGATCCRGCYTTRACCATYTCYTTYTC4、目的基因扩增以哈维氏弧菌拮抗菌株BACILLUSPUMILUSE14-3总DNA为模板，按方法4进行PCR扩增并与及T-载体连接：GCTCTAGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李联泰，安贤惠，杨乔乔，顾金付，陆红艳，
申请(专利权)人：淮海工学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32