一种外泌体的分离方法及其分离装置制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种外泌体的及其分离装置，是将含有外泌体的血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁、腹水或者羊水首先经过滤或离心除去大于1微米的杂质，然后使用孔径与外泌体直径大小对应的均匀孔径阳极氧化铝薄膜过滤，收集滤液或均匀孔径阳极氧化铝薄膜上的外泌体即可得到所需的外泌体，所用的外泌体分离装置包含使用均匀孔径阳极氧化铝薄膜作为滤膜的膜过滤器。本发明专利技术的分离方法及其分离装置，能够简单、高效地分离外泌体，并可将不同大小的外泌体进行截取、分类，以分别对不同大小的外泌体进行相应的分析、研究和应用。

A Method for Separating Exosomes and Its Separation Device

The present invention provides an exosome and its separation device, which first filters or centrifuges the blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid, milk, ascites or amniotic fluid containing the exosome to remove impurities larger than 1 micron, and then filters them by using uniform pore size anodic alumina film corresponding to the diameter of the exosome. The required exosomes can be obtained by collecting filtrate or the exosomes on the uniform pore-size anodic alumina film. The exosome separation device used includes a membrane filter using uniform pore-size anodic alumina film as the filter membrane. The separating method and the separating device of the present invention can separate exosomes simply and efficiently, and can intercept and classify exosomes of different sizes for corresponding analysis, research and application of exosomes of different sizes.

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体的分离方法及其分离装置
本专利技术涉及一种外泌体的分离方法及其分离装置。
技术介绍
外泌体(Exosome)发现于1986年，是一种直径约30～300nm的双层膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、脑脊液、乳汁、腹水、羊水等体液中。外泌体携带大量特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离：1、超速离心法(差速离心)：是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超速离心法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定(可能与转子类型有关)，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。2、密度梯度离心：在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13～1.19g/ml的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。3、超滤离心：由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。4、磁珠免疫法：外泌体表面有其特异性标记物(如CD63、CD9蛋白)，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。5、PEG-base沉淀法：聚乙二醇(PEG)可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利用PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多(假阳性)，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等，因此效果易受质疑。6、试剂盒提取：近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。这些试剂盒不需要特殊设备，随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。有些试剂盒操作简便，不用超速离心，同时可获得高纯度和高回收率的外泌体——如101bio开发的系列试剂盒，可分别针对尿液、血液、细胞上清液等多种样品进行提取，并可进一步从外泌体中获得想要的蛋白质或者RNA分子，方便快速，因而受到大多数人的欢迎，并且质量较高。然而，市场上各类产品纯化效果良莠不齐，目前仍没有绝对的方法或试剂盒能满足所有要求，从各类样品中分离到理想的外泌体。多孔阳极氧化铝薄膜是将铝作为阳极在酸性电解液中(如硫酸、草酸、磷酸、铬酸等)进行电解,即用阳极氧化的方法制得的无机膜。多孔阳极氧化铝薄膜结构示意图如图1，这种膜具有独特蜂窝状的结构，由许多六角形柱体氧化铝(Al2O3)原胞1组成，每个原胞1中间有个圆形的小孔2，在孔的下端有个半球形的阻挡层3，阻挡层3下方为铝基4。同现今广泛使用的有机膜相比，多孔阳极氧化铝薄膜具有很多独特的优点。它孔形规整，呈直圆筒状贯穿膜厚，如图2所示，孔径大小均一，分布均匀。通过改变制作多孔阳极氧化铝薄膜的电解条件并辅以适当的化学后处理，可以去除铝基体和阻挡层，并且可在几百纳米至零点几纳米的范围内自由调节孔径大小，制备出具有各种用途的精密过滤膜，即均匀孔径阳极氧化铝薄膜，与有机膜相比，它属于多孔的无机薄膜，具有良好的耐热性、化学稳定性，较高的机械强度及尺寸稳定性。除可用作常温条件下的气体分离、超滤、微滤、渗透蒸发以及血液分离膜外，均匀孔径阳极氧化铝薄膜还可用于高温气体的分离、烟道气体的脱氧、脱硫以及二氧化碳的去除等。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种外泌体的分离方法及其分离装置，能够高效、高质量分离外泌体，并可方便、快速的对分离得到的外泌体进行检测。为实现上述目标，本专利技术提供了如下技术方案：一种外泌体的分离方法，包括以下步骤：将含有外泌体的血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁、腹水或者羊水经过滤或者离心除去大于1微米的杂质；(2)使用孔径与外泌体直径大小对应的均匀孔径阳极氧化铝薄膜过滤；(3)收集滤液或均匀孔径阳极氧化铝薄膜上的外泌体。优选的，在前述的一种外泌体的分离方法中，所述步骤(1)中采用微滤膜过滤除去大于1微米的杂质。优选的，在前述的外泌体的分离方法中，所述步骤(2)采用孔径为300nm的均匀孔径阳极氧化铝薄膜或者先用孔径为300nm、再用孔径为30nm的均匀孔径阳极氧化铝薄膜过滤。为提高外泌体过滤时的通过率，前述的外泌体的分离方法中，所述步骤(2)中均匀孔径阳极氧化铝薄膜的厚度为10～60微米。优选的，前述外泌体的分离方法中，所述步骤(2)中使用的均匀孔径阳极氧化铝薄膜是按照以下步骤制作的：(1)铝片前处理：用丙酮超声清洗后再用5％氢氧化钠溶液清洗，之后用自来水冲洗，最后用去离子水冲洗，烘干备用；(2)铝片抛光：将步骤(1)备好的铝片置于体积比为4:1的乙醇:高氯酸溶液中电解抛光，抛光完后用清水及去离子水冲洗干净，放置晾干；(3)一次电解：采用硫酸，草酸或者磷酸溶液对铝片进行电解；(4)去氧化层：采用磷铬酸去除铝片上的氧化层；(5)二次电解：采用硫酸，草酸或者磷酸溶液对铝片进行电解；(6)去铝基：将铝片未经电解的一面朝下放入5％～10％的氢氧化钠溶液中把背面的氧化层去除，之后放入氯化铜溶液中去除铝基，铝基去干净后用自来水及去离子水冲洗干净并静置；(7)去除阻挡层和扩孔：将去除完铝基的阳极氧化铝薄膜正面朝上漂浮在磷酸溶液的表面10～180min后取出，放入去离子水中静置5分钟以上并冲洗干净；(8)采用激光切割成所需尺寸即得。进一步的，为减少外泌体通过均匀孔径阳极氧化铝薄膜时的表面摩擦力，提高通过率，前述的一种外泌体的分离方法中，所述步骤(2)中使用的均匀孔径阳极氧化铝薄膜在使用之前经亲水处理。优选的，前述的亲水处理的方法为：过氧化氢溶液浸泡均匀孔径阳极氧化铝薄膜10～20小时；或者用氧气等离子体清洗均匀孔径阳极氧化铝薄膜表面3～5分钟；或者用多巴胺对均匀孔径阳极氧化铝薄膜进行表面包裹。进一步的，本专利技术还提供一种采用前述方法分离外泌体的外泌体分离装置，包括膜过滤器，所述膜过滤器中的滤膜是均匀孔径阳极氧化铝薄本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外泌体的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将含有外泌体的血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁、腹水或者羊水经过滤或者离心除去大于1微米的杂质；(2)使用孔径与外泌体直径大小对应的均匀孔径阳极氧化铝薄膜过滤；(3)收集滤液或均匀孔径阳极氧化铝薄膜上的外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种外泌体的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将含有外泌体的血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁、腹水或者羊水经过滤或者离心除去大于1微米的杂质；(2)使用孔径与外泌体直径大小对应的均匀孔径阳极氧化铝薄膜过滤；(3)收集滤液或均匀孔径阳极氧化铝薄膜上的外泌体。2.根据权利要求1所述的一种外泌体的分离方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用微滤膜过滤除去大于1微米的杂质。3.根据权利要求1所述的一种外泌体的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)采用孔径为300nm的均匀孔径阳极氧化铝薄膜或者先用孔径为300nm、再用孔径为30nm的均匀孔径阳极氧化铝薄膜过滤。4.根据权利要求3所述的一种外泌体的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中均匀孔径阳极氧化铝薄膜的厚度为10～60微米。5.根据权利要求1～4中任一所述的一种外泌体的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中使用的均匀孔径阳极氧化铝薄膜是按照以下步骤制作的：(1)铝片前处理：用丙酮超声清洗后再用5％氢氧化钠溶液清洗，之后用自来水冲洗，最后用去离子水冲洗，烘干备用；(2)铝片抛光：将步骤(1)备好的铝片置于体积比为4:1的乙醇:高氯酸溶液中电解抛光，抛光完后用清水及去离子水冲洗干净，放置晾干；(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭秋泉，赵呈春，杨军，
申请(专利权)人：深圳拓扑精膜科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44