一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系和培养方法技术

本发明专利技术涉及组织培养技术领域，具体公开了一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系和培养方法。所述培养体系中仅加入两种激素，分别为2,4‑D和KT，且所述培养体系中2,4‑D和KT的质量浓度比为(1‑4):(0.05‑0.5)，优选为2,4‑D 3mg/L，KT 0.25mg/L。利用本发明专利技术所提供的培养体系可快速扩繁三七愈伤组织，愈伤组织出愈快，生长旺盛，出愈时间仅1个月，愈伤组织呈现颗粒状、结构疏松、且无褐化情况。

【技术实现步骤摘要】
一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系和培养方法
本专利技术属于组织培养
，具体地说，涉及一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系和培养方法。
技术介绍
三七，又名田七，享有“金不换”、“南国神草”、“人参之王”等美誉，为五加科人参属植物三七的根及根茎，具有止血散瘀等功效，是我国特有的名贵中药材。三七主要的化学成分包括皂苷类成分和非皂苷类成分两大类，皂苷类成分主要为达玛型四环三萜，而非皂苷类成分主要有三七素、蛋白质类、多糖类、黄酮类、炔、醇类、挥发油、微量元素及其一些其他的成分(夏鹏国，张顺仓，梁宗锁，等.三七化学成分的研究历程和概况.中草药，2014，45(17):2564-2570)。三七性甘、微苦，温，具有散瘀止血，消肿定痛的功效，多用于咯血、吐血、便血、崩漏、外伤出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛(国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药科技出版社，2010:70)。现代药理研究表明三七具有抗炎、抗肿瘤、保护心血管系统(WangZ，ChenYY，PanHJ，etal.SaponinAccumulationinFlowerBudsofPanaxnotoginseng.ChineseHerbalMedicines，2015(2):179-184)、提高免疫力作用(马岩岩.三七皂甙成分对脂多糖诱导巨噬细胞炎性因子的影响及其机制的研究.暨南大学，2013)、改善血液循环(李媛，李强，姜泽.三七中黄酮类成分的研究进展.齐鲁药事，2012，32(2):109-111)、抑制肝肿瘤细胞转移(陈培丰，刘鲁明，陈震，等.三七醇提液对恶性肿瘤肝转移的干预作用.中西医结合学报，2006，4(5):500-503)等多种药理作用。三七化学成分种类众多，药理作用广泛，成为云南白药、丹参滴丸、血塞通等中成药的主要原料药。近些年来对三七的开发利用逐渐深入，市场需求量大，三七的市场价值逐渐升高，导致供不应求。同时，人工栽培是满足三七市场需求的主要措施之一，但三七为多年生草本植物，对生态环境具有特殊要求性，生长分布区狭窄，加之连作障碍严重等问题，适宜其栽培的区域锐减。中药材质量主要是活性成分组成及其含量。活性成分多属于植物次生代谢物质，其合成积累受多种因素的影响，包括产地、品种、加工方法、采收期等。通过愈伤组织培养技术，既可以快速繁殖三七种苗，又可以直接提取次生代谢产物，是解决上述问题的途径之一(黄勇，张铁，张文生，等.三七组织培养研究综述.文山学院学报，2012；25(6)：13-15)。
技术实现思路
本专利技术的目的是在无菌条件下，采用幼嫩的外植体，通过调节激素比例，优化三七愈伤组织生长的最佳配方，提供一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系和培养方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系，所述培养体系中仅加入两种激素，分别为2,4-D和KT。作为优选，所述2,4-D和KT的质量浓度比为(1-4):(0.05-0.5)。作为优选，所述培养体系中，2,4-D的浓度为1-4mg/L，KT的浓度0.05-0.5mg/L。进一步优选，所述培养体系中，2,4-D的浓度为2-4mg/L，KT的浓度0.1-0.5mg/L。更为优选，所述培养体系中，2,4-D的浓度为3mg/L，KT的浓度0.25mg/L。进一步地，所述培养体系为按照上述浓度加入2,4-D和KT的MS培养基。第二方面，本专利技术提供了一种快速扩繁三七愈伤组织的培养方法，采用本专利技术所提供的培养体系对三七愈伤组织进行培养。所述三七愈伤组织可根据本领域常规采用的愈伤组织进行，例如，可采用三七的根、茎、叶、花、种子等作为外植体进行愈伤组织的培养。在本专利技术的具体实施方式中，以三七的根为外植体进行愈伤组织的培养作为示例性说明。本领域技术人员依据本领域常规技术知识应当知晓，所述愈伤组织并不局限于该外植体。所述培养方法具体为：将外植体消毒洗净后，吸干表面的水分，切成2mm的切片，接入到含有上述激素的MS培养基(pH为5.6-6.0，优选5.8)中，培养箱温度为25℃，暗培养。在本专利技术所述培养体系和培养方法中：2,4-D(CAS：D-7299)购买自sigma公司，精密称取10mg，先加NaOH溶液(1mol/L)溶解后，加10mL水定容，配成1mg/mL溶液，并保存于-20℃冰箱；KT(CAS：K3378)购买自sigma公司，精密称取10mg，先加HCl溶液(1mol/L)溶解后，加10mL水定容，配成1mg/mL溶液，并保存于-20℃冰箱。6-BA(CAS：B5478)购买自sigma公司，精密称取10mg，先加HCl溶液(1mol/L)溶解后，加10mL水定容，配成1mg/mL溶液，并保存于-20℃冰箱。本专利技术涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本专利技术的有益效果在于：本专利技术采用不同浓度的激素比例，从细胞生长量和褐化情况指标确定最佳激素比例，建立一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系和培养方法。附图说明图1为实施例1中不同培养体系(配方)对三七愈伤组织生长量的影响；其中：A代表使用配方A；B代表使用配方B；C(1)代表使用配方C(1)；C(2)代表使用配方C(2)。图2为实施例1中KT浓度为0.25mg/L时，不同浓度2,4-D在一个周期内(18天)对三七愈伤组织生物量的影响。图3为实施例1中2,4-D浓度为3mg/L时，不同浓度KT在一个周期内(22天)对三七愈伤组织生物量的影响。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例11、试验方法本实施例采用三七的根作为外植体，筛选出三七最佳的愈伤组织培养配方体系，建立一种三七愈伤组织快速扩繁的方法。外植体消毒程序：取根部，自来水充分冲洗，清水洗净后用吸水纸吸干表面的水分；后用75％酒精浸泡60s，0.1％HgCl2浸泡15min，用灭菌水冲洗4～5次彻底洗净残留的汞离子；再用吸水纸吸干表面的水分，切成2mm的切片，接入到不同比例激素的MS培养皿中。培养皿pH为5.8，培养箱温度为25℃，暗培养。本实施例采用3种配方，比较不同激素比例下的三七愈伤组织生长量：配方A(MS+2,4-D1mg/L+KT0.2mg/L+6-BA0.2mg/L)和配方B(MS+2,4-D2mg/L+6-BA0.5mg/L)为文献报道的配方(李云芳.三七细胞及毛状根液体培养的研究，大连工业大学，2014.潘妍.三七毛状根的诱导及液体培养技术，大连工业大学，2015)。配方C(MS+KTXmg/L+2,4-DYmg/L)为本专利技术提供的优化培养体系：(1)当KT浓度为X＝0.25mg/L时，2,4-D浓度(Y)分别为1、2、3、4mg/L；(2)当2,4-D浓度为Y＝3mg/L时，KT浓度(X)分别为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系，其特征在于，所述培养体系中仅加入两种激素，分别为2,4‑D和KT。

【技术特征摘要】
1.一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系，其特征在于，所述培养体系中仅加入两种激素，分别为2,4-D和KT。2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述培养体系中，2,4-D和KT的质量浓度比为(1-4):(0.05-0.5)。3.根据权利要求2所述的培养体系，其特征在于，所述培养体系中，2,4-D的浓度为1-4mg/L，KT的浓度0.05-0.5mg/L。4.根据权利要求3所述的培养体系，其特征在于，所述培养体系中，2,4-D的浓度为2-4mg/L，KT的浓度0.1-0.5mg/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈士林，董林林，尉广飞，张连娟，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11