一种桃果实愈伤组织培养基及其培养方法技术

本发明专利技术公开了一种桃果实愈伤组织培养基及其培养方法，该培养基包括如下成分：改良的WPM培养基为基本培养基、植物生长调节剂、蔗糖20‑40g/L和琼脂粉4.5‑6.5g/L，pH为5.5‑6.0；该培养方法，包括如下步骤：(1)桃果实的无菌化处理，(2)桃果实圆片培养；本发明专利技术愈伤组织培养基及其培养方法使得桃果实愈伤组织诱导率大大提高；通过培养桃果肉的愈伤组织能在短期内获得大量优质愈伤组织，解决桃叶片培养中愈伤组织状态不一致，愈伤组织培养成功率低的问题，为大规模培养愈伤组织提供有效途径，并且为桃的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物愈伤组织培养，具体涉及一种桃果实愈伤组织培养基及其培养方法。
技术介绍
桃原产我国，目前在我国各省区广泛栽培，在世界各地也均有栽植。桃是一种兼具营养价值、经济价值以及观赏价值的果树。目前我国对桃基因组的研究也已经开始，桃基因组研究的方向主要涉及植株抗性、果实品质果实生产特性等几个大的方面，其中桃重要经济性状尤其是与果实品质形成相关的分子机理研究也成为是桃基因组研究的热点。在桃的分子生物学研究中，多年来一直困扰研究者的一大问题是桃的转基因，目前有报道的桃的转基因仅有1-2篇，而报道中转基因效率都是极低的，因此在桃的分子生物学研究中，亟待探究一条新的方向来完成桃的某些基因功能验证。在植物分子机理研究方面，愈伤组织是常用的试验材料，也是基因工程研究中进行基因转化所必需的试验材料。愈伤组织是指外植体在离体培养条件下，形成的一团无极性、能旺盛分裂的薄壁细胞团，在培养过程中，经过诱导分化可以发育成完整的再生植株。愈伤组织是植物的外植体经过脱分化形成的，多种外植体都可以经过组织培养诱导形成愈伤组织，而植物愈伤组织因为具有以下特点而被广泛应用于植物分子机理和基因工程研究中。愈伤组织的特点：①无性繁殖，大量扩繁；②为细胞悬浮培养和次生代谢产物生产与利用、原生质体培养和细胞融合提供材料；③为植物体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的体系和基础；④为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操对象；⑤为离体研究植物组织和细胞分裂、分化、代谢和状态的转变创造适宜的材料和体系。目前对于桃愈伤组织的研究多集中研究叶片的愈伤组织，然而，随着桃分子生物学研究的不断深入，仅仅研究单一器官或者组织的的愈伤组织培养，显然不能满足研究需要。而对于桃来说理论上虽然所有器官和组织都可以作为外植体，但是实现的过程比较复杂，也很难。目前桃的研究中，对果实品质形成以及果实成熟发育的分子机理研究是一大热点，因此，想要研究果实的发育，就必须获得相应果实的愈伤组织来研究桃果实品质形成以及果实成熟发育分子机理。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种桃果实愈伤组织培养基及其培养方法；本专利技术使得桃果实愈伤组织诱导率大大提高；通过培养桃果肉的愈伤组织能在短期内获得大量优质愈伤组织，解决桃叶片培养中愈伤组织状态不一致，愈伤组织培养成功率低的问题，为大规模培养愈伤组织提供有效途径，并且为桃的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供一种桃果实愈伤组织培养基，包括如下成分：改良的WPM培养基为基本培养基、植物生长调节剂、蔗糖20-40g/L、琼脂粉4.5-6.5g/L，pH为5.5-6.0。作为优选，所述改良的WPM培养基为每一升WPM培养基含有：KNO3硝酸钾300-500mg/L、K2SO4硫酸钾800-1000mg/L、MgSO4.7H2O七水合硫酸镁350-400mg/L、KH2PO4磷酸二氢钾150-200mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰15-25mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8.0-9.0mg/L、H3BO3硼酸6.0-6.5mg/L、CuSO4.5H2O五水合硫酸铜0.03-0.08mg/L、NaMoO4.2H2O二水合钼酸钠0.1-0.4mg/L、Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁8-12mg/L、CaCl2.2H2O二水合氯化钙80-120mg/L、Ca(NO3)2.4H2O四水硝酸钙550-650mg/L、肌醇80-120mg/L、烟酸0.8-1.2mg/L、维生素B10.8-1.2mg/L、维生素B6 1.5-2.5mg/L、维生素C 1.5-2.5mg/L。作为优选，所述植物生长调节剂为TDZ 1-2mg/L、2，4-D 0.2-2mg/L、ZT 1-3mg/L、6-BA 0.2-0.8mg/L、IBA 0.1-0.3mg/L中的任意几种的组合。TDZ是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，且可以对植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，是一个作用力很强的植物生长调节剂，在农业上有广泛的应用和推广价值。2,4-D对于愈伤组织的诱导和生长非常有效，是组织培养中常用的植物生长调节剂，本专利技术中添加2,4-D能够很好的诱导桃愈伤组织的形成。ZT为玉米素(Zeatin)，是存在于高等植物的一种天然植物细胞分裂素不仅促进侧芽生长，刺激细胞分化(侧端优势)，促进愈伤组织和种子发芽，还能防止叶片衰老，逆转芽部受到的毒素伤害和抑制过度根部形成。高浓度的玉米素还能产生不定芽分化，玉米素在之前报道的愈伤组织培养中很少用到，因为桃果实材料的特殊性，因此使用玉米素来诱导愈伤组织。IBA为吲哚丁酸，是组织培养中常用的植物生长调节剂，对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，是一种细胞分裂素类的物质，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点是组织培养者最喜爱的细胞分裂素，可以诱导愈伤组织发生。但是一般在诱导愈伤组织发生时浓度不宜过高，本专利技术中添加6-BA能够很好的诱导‘玉露’桃果实愈伤组织的形成。蔗糖在植物组织培养基中起到能源物质和渗透调节剂的作用，除供能之外，还能诱导愈伤组织的再分化，使用工业生产的分析纯的蔗糖，在本专利技术中，因为所选植物材料是果肉，果肉本身含有糖分，因此培养时蔗糖浓度不宜过高，本试验中所用蔗糖为30g/L。琼脂粉在培养基中主要的作用是固定支撑的作用，一般使用纯度较高，没有杂质的琼脂粉。本专利技术还提供一种桃果实愈伤组织的培养方法，包括如下步骤：(1)桃果实的无菌化处理：选取桃果实，将果实表面洗干净，在无菌条件下进行消毒，消毒完成后削去表面果皮，从果实中间切开，选取果心到果皮的中间部分，切成圆片，接种于愈伤组织培养基上；(2)桃果实圆片培养：将步骤(1)中接种圆片的愈伤组织培养基在黑暗条件下20-30℃培养10-25天后，果实原片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤组织接种于愈伤组织培养基中，培养25-30天；愈伤体积变为原来体积的3-4倍大小，增殖后的愈伤组织一部分可以用来做分子生物学以及基因工程相关试验，剩余的一部分可以再次接种于培养基中继续增殖培养，供后续试验所用。作为优选，所述步骤(1)中桃果实为‘玉露’桃花后30-70天的桃果实。作为优选，所述步骤(1)中切成圆片为切成0.2-0.4厘米的圆片。所述步骤(1)将果实表面洗干净包括将桃表面的毛清理干净。将桃表面的毛清理干净不容易导致污染。作为优选，所述步骤(1)在无菌条件下进行消毒具体步骤为：用70-80％的乙醇消毒1-2分钟后用无菌去离子水冲洗2-4次，然后用0.05-0.15％的升汞消毒7-9分钟，再用无菌去离子水冲洗8-10次，用无菌滤纸吸干果皮表面水分。本专利技术所用果肉来直接来自于桃果实，而果实取材时只需要根据开花后的天数取，实验材料的年龄和生理状态能够保持高度的一致性。从一个果实上取全部果肉就能够培养出大量的愈伤组织，而来自于同一果实的愈伤组织无论是生理状态还是基因型还是年龄都是完全一致的，无论后期将愈伤组织用于任何试验，都能够保证实验基础高度一致，不会对试验造本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桃果实愈伤组织培养基，其特征在于，包括如下成分：改良的WPM培养基为基本培养基、植物生长调节剂、蔗糖20‑40g/L和琼脂粉4.5‑6.5g/L，pH为5.5‑6.0。

【技术特征摘要】
1.一种桃果实愈伤组织培养基，其特征在于，包括如下成分：改良的WPM培养基为基本培养基、植物生长调节剂、蔗糖20-40g/L和琼脂粉4.5-6.5g/L，pH为5.5-6.0。2.根据权利要求1所述桃果实愈伤组织培养基，其特征在于，所述改良的WPM培养基为每一升WPM培养基含有：KNO3硝酸钾300-500mg/L、K2SO4硫酸钾800-1000mg/L、MgSO4.7H2O七水合硫酸镁350-400mg/L、KH2PO4磷酸二氢钾150-200mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰15-25mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8.0-9.0mg/L、H3BO3硼酸6.0-6.5mg/L、CuSO4.5H2O五水合硫酸铜0.03-0.08mg/L、NaMoO4.2H2O二水合钼酸钠0.1-0.4mg/L、Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁8-12mg/L、CaCl2.2H2O二水合氯化钙80-120mg/L、Ca(NO3)2.4H2O四水硝酸钙550-650mg/L、肌醇80-120mg/L、烟酸0.8-1.2mg/L、维生素B1 0.8-1.2mg/L、维生素B6 1.5-2.5mg/L、维生素C 1.5-2.5mg/L。3.根据权利要求1所述桃果实愈伤组织培养基，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王媛花，蔡善亚，史红林，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32