一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基及方法技术

本发明专利技术一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基及方法，属于植物组织培养技术领域。诱导胚状愈伤组织产生的培育基由MS培养基和添加物2,4‑D、IAA、KT和PQQ组成：MS培养基的浓度为4.42g/L；2,4‑D的浓度为0.2～0.6μmol/L；IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；KT的浓度为0.2～0.6μmol/L的；PQQ的浓度为100～1000nmol/L。方法包括如下步骤：(1)外植体选取和灭菌；(2)采用上述培养基进行诱导胚状愈伤组织培养；(3)诱导胚状体培养；(4)体细胞胚胎萌发；(5)成苗培养；(6)再生苗的移栽；(7)大棚培养。本发明专利技术外植体选用博落回的茎、叶，培养基在常用植物激素的基础上加以PQQ，本发明专利技术提供的培养基及方法能达到快速、高产能培育博落回组培幼苗的目的，能大大缩短博落回成苗时间，适用于大面积生产。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基及方法
本专利技术属于博落回植物组织培养
，具体来说是一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基及方法，尤其涉及一种体细胞快速诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法。
技术介绍
博落回[Macleayacordata(Willd)R.B]是罂粟科博落回属多年生植物，是一种重要的传统药用植物，活性成分主要为异喹啉类生物碱，主要包括血根碱(sanguinarine，SA)，白屈菜红碱(chelerythrine，CHE)，原阿片碱(protopine，PRO)和别隐品碱(allocryptopine，ALL)等，具有抗炎杀菌、抗肿瘤、改善肝功能、调节胃肠等显著生物活性。博落回提取物已被批准为我国的第一个二类新中兽药药物饲料添加剂[(2011)新兽药证字33号，34号]。欧盟从2006年1月开始严禁在饲料中添加任何抗生素，德国将博落回开发成饲料添加剂用以在长期使用过程中替代抗生素；而美国将血根碱开发成抗炎牙膏和漱口水，用于预防牙龈肿痛和口腔溃疡。随着对博落回资源的开发和利用，使得博落回植物需求量大增，如今主要是通过大规模采集野生资源来获得。驯化博落回资源，实现规模化种植是当前需要迫切解决的重大课题，而育种是当前必须解决的核心问题。博落回现在主要的繁殖方式有种子繁殖、分根繁殖等，而组织培养作为优良育种方式的一种重要方法，不仅具备有稳定遗传的特点，而且还具备有不受季节影响，能够大幅缩短育种年限等优势。所以探索出一种快速诱导博落回外植体产生愈伤的组培方式不仅仅满足科研的需求，更是生产的需要。中国专利申请CN103404441A公开一种博落回体细胞胚胎发生和植株再生的方法，中国专利申请CN103404442A公开博落回花药离体单倍体胚胎发生及植株再生的方法，中国专利申请CN105794652A公开一种博落回组织培养快速繁殖的方法。在中国专利申请CN103404442A中受博落回开花时间影响，具有时节性，无法常年工作；而中国专利申请CN105794652A中，根据专利说明，该方法从外植体到植株形成需要82～105天，耗时长，效率不高；中国专利申请CN103404441A外植体到植株形成需要75～105天也存在耗时长的问题。吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone又名Methoxatin，以下简称PQQ)，化学名称4,5-二氢-4,5-二氧-1氢-吡咯并(2,3-f)喹啉-2,7,9-三羧酸，是甲醇脱氢酶的辅酶，能参与某些氧化还原酶类的催化反应。根据文献报道，PQQ能够促进微生物细胞的生长，其在缩短菌体的迟缓期的同时还不影响菌体细胞的生长速度，在多地发现的“太岁”体内均含有高浓度的PQQ；PQQ为人和动物生长发育不可缺少的辅助因子，有文献报道其能够营养、保护神经细胞，能够保护心脏，能够解毒、护肝，此外还具有抗炎、抗肿瘤、预防白内障、调节骨代谢平衡等作用；此外PQQ还能刺激植物细胞生长，1988年就有报道PQQ能够刺激百合花粉萌发，能够通过加快呼吸速率促进烟草种子萌发，PQQ还能通过促进生长素与细胞分裂素合成，提高新陈代谢水平而发挥促进植物生长的作用，其还可以通过减缓SODASAPOD酶活性和GSH含量在低温胁迫下急剧下降从而缓解低温胁迫对黄瓜幼苗的损伤。但是将其运用到植物组织培养中的报道尚未见到。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基及方法，是一种利用体细胞快速诱导博落回胚状愈伤组织产生，并加快根系生长的组织培养方法，以解决现在博落回野生资源日益减少，而需求量日益增加之间的矛盾现状，该方法对传统组织培养技术进行改良，使得其生长周期加快，便于快速、高效的培育质量均一的博落回资源，更好的应用于博落回科学研究与实际生产。为了实现上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：首先，提供一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基，所述培育基的组成如下：MS培养基+0.2～0.6μmol/L的2,4-D+4.0～6.5μmol/L的IAA+0.2～0.6μmol/L的KT+25～100μmol/L的PQQ。本专利技术还提供采用上述培养基，利用体细胞快速诱导博落回胚状愈伤组织发生植株再生的方法，包括以下步骤：(1)外植体选取和灭菌：将叶片剪成小块，嫩枝剪切成小段，清洗消毒，备用；(2)诱导胚状愈伤组织培养：将处理好的叶片、嫩枝接种到培养基一上，暗培养条件下诱导胚状愈伤组织产生；所述培育基一由MS培养基和添加物组成，所述添加物包括2,4-D、IAA、KT和PQQ；所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述2,4-D的浓度为0.2～0.6μmol/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L的；所述PQQ的浓度为100～1000nmol/L；(3)诱导胚状体培养：将步骤(2)得到的愈伤组织转接到培养基二上，暗培养条件下诱导胚状体产生；所述培养基二由MS培养基和GA3组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述GA3的浓度为0.1～0.5μmol/L；(4)体细胞胚胎萌发：将步骤(3)得到的胚状体转接到培养基三上光暗结合培养；所述培养基三由MS培养基、IAA和KT组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L；(5)成苗：将步骤(4)萌发的胚状体转接到培养基四上光暗结合培养；所述培养基四由MS培养基和PQQ组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述PQQ的浓度为25～200μmol/L；(6)再生苗的移栽：步骤(5)将生根苗组培瓶拧开，加入少量水，放置1～2天后移栽到装有炼苗基质的炼苗盒中，进行正常水肥管理；(7)大棚培养：炼苗盒中炼苗两周后移栽到大棚，进行正常水肥管理。上述方案中：1、MS培养基：是指Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。2、2,4-D：2，4-二氯苯氧乙酸，具有代表性的合成植物生长素，是一种生长素类似物，以下简称2,4-D。在普通的植物生长素定量法中显示有高的活性，但在采用植物生长素标准定量法的燕麦伸长试验中，其效颇低。3、IAA：吲哚-3-乙酸，英文全称indole-3-aceticacid，亦称吲哚乙酸，简称“IAA”，是一种用作刺激植物生长的激素类试剂，广泛应用于农业生产中。4、KT：kinetin，激动素，细胞分裂素的一种。激动素是一种非天然的细胞分裂素，化学名称为6-糠基氨基嘌呤(或N6-呋喃甲基腺嘌呤)，分子式C10H9N5O。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基，其特征在于，所述培育基由MS培养基和添加物组成，所述添加物包括2,4‑D、IAA、KT和PQQ；所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述2,4‑D的浓度为0.2～0.6μmol/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L的；所述PQQ的浓度为100～1000nmol/L。

【技术特征摘要】
1.一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基，其特征在于，所述培育基由MS培养基和添加物组成，所述添加物包括2,4-D、IAA、KT和PQQ；所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述2,4-D的浓度为0.2～0.6μmol/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L的；所述PQQ的浓度为100～1000nmol/L。2.一种诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体选取和灭菌：将叶片剪成小块，嫩枝剪切成小段，清洗消毒，备用；(2)诱导胚状愈伤组织培养：将处理好的叶片、嫩枝接种到培养基一上，暗培养条件下诱导胚状愈伤组织产生；所述培育基一由MS培养基和添加物组成，所述添加物包括2,4-D、IAA、KT和PQQ；所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述2,4-D的浓度为0.2～0.6μmol/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L的；所述PQQ的浓度为100～1000nmol/L；(3)诱导胚状体培养：将步骤(2)得到的愈伤组织转接到培养基二上，暗培养条件下诱导胚状体产生；所述培养基二由MS培养基和GA3组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述GA3的浓度为0.1～0.5μmol/L；(4)体细胞胚胎萌发：将步骤(3)得到的胚状体转接到培养基三上光暗结合培养；所述培养基三由MS培养基、IAA和KT组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L；(5)成苗：将步骤(4)萌发的胚状体转接到培养基四上光暗结合培养；所述培养基四由MS培养基和PQQ组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述PQQ的浓度为25～200μmol/L；(6)再生苗的移栽：步骤(5)将生根苗组培瓶拧开，加入少量水，放置1～2天后移栽到装有炼苗基质的炼苗盒中，进行正常水肥管理；(7)大棚培养：炼苗盒中炼苗两周后移栽到大棚，进行正常水肥管理。3.根据权利要求2所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(1)首先将叶片剪成边长为8～12厘米的正方形，嫩枝剪切成长度8～...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾建国，余林岚，
申请(专利权)人：湖南美可达生物资源股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43