一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法技术

本发明专利技术属于植物组织培养技术领域。具体涉及三明野生黄精无菌体系建立与组织培养的方法。依次包括以下步骤：(1)三明野生黄精外植体准备：取当年冬季和来年春季两季的三明野生黄精块茎为外植体，按节间长短切成小块，进行消毒接种；(2)三明野生黄精外植体消毒试剂的准备；(3)三明野生黄精外植体消毒前处理；(4)三明野生黄精的消毒与接种；(5)三明野生黄精不定芽诱导培养基；(6)三明野生黄精污染情况统计及出芽个数统计。采用本发明专利技术方法，能够快速获得三明野生黄精的不定芽，利于产业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法
本专利技术涉及三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导，属于植物组织培养
，主要应用于三明野生黄精无菌体系建立与组织培养。
技术介绍
三明市地处闽中西部，主要以山地为主,海拔分布从50-1857.7米,属中亚热带海洋性季节气候、年平均温度15～19℃，气候及海拔高度非常适宜黄精属植物的生长。黄精（PolygonatumcyI'toD．erllaHua）属于百合科（Liliaceae）黄精属（Polygonatum）具肉质根状茎多年生药用草本植物，俗称野生姜、山生姜。其主要生物学特性为横生，宿存，呈圆柱状、连珠状或不规则姜块状，直径0.5-3.5cm，有节，年久者肥大，节膨大或不膨大，节间长或短，粗细均匀或一头粗一头细，不分支或少分支，表面浅黄色至黄褐色，茎痕呈圆盘状，中心常略有凹陷；根茎含有黄精多糖、甾体皂苷、蒽醌类化合物和生物碱、木脂素、维生素及多种对人体有用的氨基酸等种物质，能增强机体的免疫、延缓衰老、抗菌、抗病毒和降脂、降糖作用。故其为兼具食用、药用和观赏价值的经济植物，具有广阔的开发利用前景。但由于其黄精生长周期长，种子繁殖至少5年以上才能收获，块茎繁殖也至少需要3年，仅靠野生资源做为原料来生产药品远不能满足整个医药市场的需求。因此，建立更加高效的无菌体系和芽诱导培养基的筛选是目前黄精快速繁殖的重要突破口。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导，采用植物组织培养技术，通过无菌体系建立中各影响因子的筛选和培养基配方的优化，获得低污染率，较高芽诱导率的三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导方法。本方法操作步骤简便、可缩短三明野生黄精正常情况下块茎的生长年限，缩短黄精繁殖周期，为工厂化育苗提供参考。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导方法，包括以下步骤：(1)三明野生黄精外植体准备；(2)三明野生黄精外植体消毒试剂的准备；(3)三明野生黄精外植体消毒前处理；(4)三明野生黄精的消毒与接种；(5)三明野生黄精不定芽诱导培养基筛选；(6)三明野生黄精污染情况统计及出芽个数统计。采用植物组织培养技术，对先对三明野生黄精块茎用洗衣粉在自来水下冲洗过夜，在用多菌灵浸泡2d，能明显降低三明野生黄精块茎外植体初代培养污染率，采用6-BA浓度4.0mg/L能有效提高黄精块茎芽诱导率。具体方法为：步骤(1)三明野生黄精外植体准备的方法为：取冬季12月与春季3月的野生黄精块茎进行外植体活力对比试验，将冬季野生黄精去除须根，春季野生黄精去除须根和地上叶。选表面浅黄色至黄褐色，生活力较强的地下块茎为外植体，洗去块茎表面的泥土，尤其是黄精块茎节间部分拨开分段仔细清洗，进行不同预消毒处理。步骤(2)三明野生黄精外植体消毒试剂的准备方法为：a、配制1wt%HgCl2母液，稀释成0.2wt%的浓度备用；b、采用多菌灵粉末配制3wt%多菌灵溶液，作为消毒前外植体灭菌试剂备用。步骤(3)三明野生黄精外植体预消毒处理方法为：将步骤(1)中获得的外植体进行3种不同的预消毒处理：a、采用3wt%多菌灵浸泡3d，期间时常震荡摇晃，在清水下用软毛牙刷清洗块茎表面残留的多菌灵，盛放于瓷杯中，获得正式消毒前的外植体；b、不加多菌灵表面预消毒，将块茎按步骤(1)获得后晾干3d，获得消毒前外植体备用；c、块茎按步骤(1)获得后，先用洗衣粉在自来水下开到最大，冲洗16h，再用3wt%多菌灵浸泡2d，期间时常震荡摇晃，在清水下用软毛牙刷清洗块茎表面残留的多菌灵，在滤纸上晾放5h后进行外植体消毒。步骤(4)三明野生黄精的消毒与接种方法为：将预消毒处理或晾干获得的外植体分装于瓷杯中，采用不同的消毒组合和不同的接种方式进行无菌体系建立的优化。基础消毒步骤为：①将预消毒处理过的外植体置于紫外好的超净工作台上，用无菌水清洗2次；②用75%酒精浸泡30s；③用0.2wt%HgCl2浸泡15min，同时滴一滴吐温20；④无菌水清洗4-5遍至干净；⑤将消毒好的块茎置于滤纸上，表面晾干；⑥接种于配制好的培养基中，切口处与培养基接触，每瓶培养基只接一块，春季材料块茎较小可适当接种3-4块。进行12h黑暗12h光照培养，及时观察污染情况。⑥中不同的接种方式分为三种：A、未去除块茎表面的表皮，仅将块茎按节间大小切成的大小不一的小块进行野生黄精的初代消毒培养；B、结合预实验结果，切去块茎表面表皮，进行消毒培养；C、未切除块茎表面表皮，仅切除块茎节间拨开处与消毒剂接触的切面，根据块茎节间大小切成小块；步骤(5)三明野生黄精不定芽诱导培养基为：采用步骤(3)(4)中对比试验后的最佳处理组合获得的外植体接入不同芽诱导培养基中：（1）MS+6-BA4mg/L+NAA0.2mg/L+30g蔗糖+7g琼脂pH5.8；（2）MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+30g蔗糖+7g琼脂pH5.8；（3）MS+6-BA10mg/L+NAA0.2mg/L+30g蔗糖+7g琼脂pH5.8。15d观察块茎的污染情况与出芽情况。本专利技术只需在3wt%多菌灵预消毒前用洗衣粉在自来水下冲洗一夜后，采用0.2wt%HgCl2消毒15min即可将污染率降低到20.16%；同时通过不同激素浓度芽诱导培养基筛选试验，筛选出芽诱导率高达88%。优化后的三明野生黄精无菌体系在组织培养过程中可以缩短黄精块茎生长周期，有利于后期工厂化试管苗培育，所以本方法操作步骤简便、成本降低、时间更短，污染率低芽诱导率高。本专利技术的优点在于：1、在已有的黄精快繁的无菌体系建立条件下，进一步明确影响黄精污染率的重要因素，材料选择上，春季3月的野生黄精块茎进行组培体系建立优于冬季休眠的块茎。2、本专利技术在3wt%多菌灵处理前仅采用洗衣粉冲洗一夜，而后用0.2wt%HgCl2正常消毒，简便易操作，并且显著降低污染率。3、本专利技术在建立三明野生黄精无菌体系的同时发现黄精的生长点在块茎的表皮，且表皮上残留微生物或泥土是造成污染的重要因素，若去除表皮消毒，可以大大降低污染率，但同时块茎损伤较大，不利于块茎芽诱导。4、0.2wt%HgCl2是黄精块茎消毒的最佳消毒剂，且消毒15min最优。5、设计不同浓度6-BA组合的培养基，筛选出最有利于三明野生黄精芽诱导的培养基组合。附图说明图1三明野生黄精试验图片；其中A图为采用3wt%多菌灵浸泡三明野生黄精块茎；B图为三明野生黄精接种块茎；C图为三明野生黄精接种数量；D、E、F图为三明野生黄精芽诱导情况。具体实施方式为进一步公开而不是限制本专利技术，以下结合实例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1(1)三明野生黄精外植体准备；本试验于2018年1月开始，取冬季12月的三明野生黄精块茎进行外植体消毒试验。将冬季野生黄精去除须根，选择表面浅黄色至黄褐色，较嫩的生活力较强的地下块茎为外植体，用毛刷洗去块茎表面的泥土，尤其是黄精块茎节间部分拨开分段仔细清洗。(2)三明野生黄精外植体消毒试剂的准备及培养基配制；用HgCl2粉末配制1wt%HgCl2母液，稀释成0.2wt%的浓度备用；采用多菌灵粉末配制3wt%多菌灵溶液，作为消毒前外植体灭菌试剂备用。配制（1）MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+30g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于：依次包括以下步骤：(1)三明野生黄精外植体准备；(2)三明野生黄精外植体消毒试剂的准备；(3)三明野生黄精外植体消毒前处理；(4)三明野生黄精的消毒与接种；(5)三明野生黄精不定芽诱导培养基筛选；(6)三明野生黄精污染情况统计及出芽个数统计。

【技术特征摘要】
1.一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于：依次包括以下步骤：(1)三明野生黄精外植体准备；(2)三明野生黄精外植体消毒试剂的准备；(3)三明野生黄精外植体消毒前处理；(4)三明野生黄精的消毒与接种；(5)三明野生黄精不定芽诱导培养基筛选；(6)三明野生黄精污染情况统计及出芽个数统计。2.根据权利要求1所述的一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于，步骤(1)所述的三明野生黄精外植体准备的方法为：选取冬季12月三明野生黄精块茎与春季3月的野生黄精植株进行外植体消毒时本身活力的对比试验，冬季野生黄精去除须根，春季野生黄精去除须根和地上叶；选色泽鲜黄，生活力较强的地下块茎为外植体，用软毛牙刷在清水下洗去野生黄精块茎表面的泥土，尤其是黄精块茎节间部分可以拨开分段仔细清洗，获得预消毒前干净的外植体。3.根据权利要求1所述的一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于，步骤(2)所述的三明野生黄精外植体消毒试剂的准备方法为：a、采用配制好的1wt%HgCl2母液，稀释成0.2wt%的浓度备用；b、采用多菌灵粉末配制3wt%的多菌灵溶液，作为消毒前外植体灭菌试剂备用。4.根据权利要求1所述的一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于，步骤(3)三明野生黄精外植体预消毒处理方法为：将步骤(1)中获得的干净外植体进行不同的预消毒处理；具体为以下3种方法中的任意一种：a、采用3wt%多菌灵浸泡3d，期间时常震荡摇晃，在清水下用软毛牙刷清洗块茎表面残留的多菌灵，盛放于瓷杯中，获得正式消毒前的外植体；b、不加多菌灵表面预消毒，将块茎按步骤(1)获得后晾干3d，获得消毒前外植体备用；c、块茎按步骤(1)获得后，先用洗衣粉在自来水下开到最大，冲洗16h，再用3wt%多菌灵浸泡2d，期间时常震荡摇晃，在清水下用软毛牙刷清洗块茎表面残留的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖钟雄，林玉玲，徐小萍，郭志鹏，王锦锋，吕煜梦，陈裕坤，张梓浩，苏立遥，邵颜平，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35