人β-防御素3的新用途及其制备方法技术

本发明专利技术公开了人β‑防御素3的新用途及其制备方法，本发明专利技术提出了人β‑防御素3在制备治疗真菌尤其是丝状真菌感染性疾病药物中的应用。本发明专利技术提供了重组人β‑防御素3多肽的制备方法，将HBD3成熟肽基因插入pET32a(+)质粒，将构建正确的重组质粒转入大肠杆菌获得表达工程菌，诱导培养表达工程菌表达HBD3融合蛋白，最后再通过镍亲和层析、凝血酶酶切、纯化、浓缩获得重组人β‑防御素3多肽。本发明专利技术中提出了人β‑防御素3的新用途。本发明专利技术中的方法具有造价低廉、产量多且容易保证多肽的生物学活性的特点。

【技术实现步骤摘要】
人β-防御素3的新用途及其制备方法
本专利技术涉及一种活性小分子蛋白质的新用途及其制备方法，特别是人β-防御素3的新用途及其制备方法。
技术介绍
近年来，随着广谱抗生素、激素、免疫抑制剂的广泛应用，以及AIDS的蔓延、器官移植和介入技术的推广应用，使真菌感染的发病率呈现上升趋势，2014年的真菌感染率为20世纪90年代的数倍，念珠菌属和曲霉属是目前最常见的真菌感染的病原菌，某些真菌引起的系统性感染致死率高达90％。对于艾滋病患者(AIDS)，真菌感染是最常见的机会性感染，其发病率和死亡率均较高。虽然不同作用机制的抗真菌药物在治疗真菌感染中发挥了重要作用，但随着感染菌种逐渐发生变化，有关耐药菌株的报道逐渐增多，使得真菌感染的治疗面临着严峻的挑战。人β-防御素广泛分布于人、鼠、牛、羊、猪的多种器官上皮细胞内，包括皮肤、呼吸道、尿道、肠道和口腔粘膜上皮细胞等。关于人β-防御素的抗微生物活性，已证实人工合成的人β-防御素具有抗金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的作用。但关于人β-防御素3抗丝状真菌的作用未见相关报道。人工合成的人β-防御素，造价昂贵、产量少且不易保证多肽的生物学活性。目前，已经运用生物信息学方法发现了大约30种人β-防御素基因。β-防御素的基因上游启动子有前NF-κB、IL-6和STAT等的结合位点，当病原体相关模式分子(PAMP)与上皮细胞表面的模式识别受体(包括CD14，TLRs等)结合后，在多种促炎因子(TNF-α，IL-1)参与下，激活NF-κB等转录因子，再与启动子区的NF-κB、IL-6结合位点结合，使其基因激活并转录和翻译，属于诱导性表达。因此，现有技术中未发现人β-防御素3抗真菌相关的应用，尤其是抗丝状真菌相关的应用。现有的人β-防御素3的合成方法，存在造价昂贵、产量少且不易保证多肽的生物学活性的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的，是提供人β-防御素3的新用途及其制备方法。本专利技术提出了人β-防御素3在制备治疗真菌感染性疾病药物中的应用，尤其是在制备治疗丝状真菌感染性疾病药物中的应用。本专利技术提供了一种重组人β-防御素3多肽(recombinanthumanbeta-defensin3,rHBD3)的制备方法。本专利技术中重组人β-防御素3多肽的制备方法具有造价低廉、产量多且容易保证多肽的生物学活性的特点。本专利技术的技术方案：人β-防御素3的新用途，人β-防御素3在制备治疗真菌感染性疾病药物中的应用。前述的人β-防御素3的新用途中，所述真菌感染性疾病为丝状真菌感染性疾病。前述的人β-防御素3的新用途中，所述的人β-防御素3为重组人β-防御素3多肽。前述的人β-防御素3的新用途中，取人β-防御素3，加入一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，制备成各种治疗真菌感染的药物制剂。前述的人β-防御素3的新用途中，所述的治疗真菌感染的药物制剂为口服制剂：片剂、胶囊剂、口服液、混悬液；或者注射制剂：可注射的溶液、混悬液、粉针剂；或者外用制剂：乳膏剂或溶液。前述的人β-防御素3的新用途中，所述重组人β-防御素3多肽的制备方法，根据genbank提供的HBD3基因序列，合成HBD3成熟肽基因；将HBD3成熟肽基因插入pET32a(+)质粒；将构建正确的重组质粒转入大肠杆菌Rossetta-gami(2)，获得表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD3；诱导培养表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD3表达HBD3融合蛋白，收集菌细胞内容物；通过镍亲和层析将细胞内容物中的HBD3融合蛋白纯化，利用凝血酶酶切HBD3融合蛋白中由pET32a(+)质粒所赋予的标签蛋白，再经镍亲和层析纯化、脱盐、浓缩获得重组人β-防御素3多肽。前述的重组人β-防御素3多肽的制备方法中，所述HBD3成熟肽基因插入pET32a(+)质粒，是先将HBD3成熟肽基因和pET32a(+)质粒用BamHⅠ和XholⅠ分别进行酶切反应，再在T4DNA连接酶的作用下将酶切后的HBD3成熟肽基因和酶切后的pET32a(+)进行连接反应。前述的重组人β-防御素3多肽的制备方法中，所述连接反应中，酶切后的HBD3成熟肽基因与酶切后的pET32a(+)质粒的分子摩尔数比为(3～10):1。前述的重组人β-防御素3多肽的制备方法中，所述表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD3经IPTG诱导表达HBD3融合蛋白。前述的重组人β-防御素3多肽的制备方法中，所述工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD3表达HBD3融合蛋白，最优表达条件为,最佳IPTG浓度为0.5mM，最佳诱导时间为6h，最佳温度为34℃。与现有技术比较，本专利技术得出人β-防御素3可破坏菌细胞结构，对单细胞真菌和多细胞真菌均具有抑制或杀灭作用。本专利技术提出了人β-防御素3在制备治疗真菌感染性疾病药物中的应用，尤其是在制备治疗丝状真菌感染性疾病药物中的应用，扩大了人β-防御素3的应用范围。本专利技术提供了一种人β-防御素3(重组人β-防御素3多肽)的制备方法。该制备方法将HBD3成熟肽基因插入pET32a(+)质粒，将构建正确的重组质粒转入大肠杆菌Rossetta-gami(2)获得表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD3，诱导培养表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD3表达HBD3融合蛋白，最后再通过镍亲和层析、凝血酶酶切、纯化、浓缩获得重组人β-防御素3多肽(recombinanthumanbeta-defensin3,rHBD3)。本专利技术为人β-防御素3多肽的制备提供了新途径。该制备方法具有造价低廉、产量多且容易保证多肽的生物学活性的特点。附图说明图1为pET32a(+)质粒结构示意图；图2为pET32a(+)/HBD3原核重组质粒结构示意图；图3为pET32a(+)/HBD3重组质粒的双酶切鉴定结果，图中的标记为：1-pET32a(+)/HBD3重组质粒(未酶切)，2-pET32a(+)/HBD3重组质粒Xhol和Apal双酶切产物，M-DNA标准分子量Marker；图4为pET32a(+)/HBD3重组质粒的测序结果；图5为HBD3融合蛋白诱导表达SDS-PAGE凝胶电泳结果，图中的标记为：M-蛋白质标准分子量Marker，1-Rossetta-gami(2)-pET32a(+)/HBD3诱导产物，2-Rossetta-gami(2)-pET32a(+)/HBD3未诱导产物；图6为HBD3融合蛋白的WesternBlot鉴定结果，图中的标记为：1-Rossetta-gami(2)-pET32a(+)未经IPTG诱导，2-Rossetta-gami(2)-pET32a(+)/HBD3经IPTG诱导；图7为重组HBD3多肽的SDS-PAGE电泳结果，图中的标记为：M-蛋白质标准分子量Marker，1-酶切产物穿透液，2-Elutionbuffer洗柱的穿透液，3-酶切产物；图8为重组HBD3多肽的WesternBlot鉴定结果，图中的标记为：1-重组HBD3融合蛋白，2-纯化的rHBD3，3-Rossett本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人β‑防御素3的新用途，其特征在于：人β‑防御素3在制备治疗真菌感染性疾病药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.人β-防御素3的新用途，其特征在于：人β-防御素3在制备治疗真菌感染性疾病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的人β-防御素3的新用途，其特征在于：所述真菌感染性疾病为丝状真菌感染性疾病。3.根据权利要求1或2所述的人β-防御素3的新用途，其特征在于：所述的人β-防御素3为重组人β-防御素3多肽。4.根据权利要求3所述的人β-防御素3的新用途，其特征在于：取人β-防御素3，加入一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，制备成各种治疗真菌感染性疾病药物制剂。5.根据权利要求3或4所述的人β-防御素3的新用途，所述重组人β-防御素3多肽的制备方法，其特征在于：根据genbank提供的HBD3基因序列，合成HBD3成熟肽基因；将HBD3成熟肽基因插入pET32a(+)质粒；将构建正确的重组质粒转入大肠杆菌Rossetta-gami(2)，获得表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD3；诱导培养表达工程菌Rosseta-gami(2)-pET32a(+)/HBD3表达HBD3融合蛋白，收集菌细胞内容物；通过镍亲和层析将细胞内容物中的HBD3融合蛋白纯化，利用凝血酶酶切HBD3融合蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：江滟，沈祥春，杨红宇，易旭，罗红，兰露莎，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52