疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的应用。本发明专利技术以疥螨几丁质酶样蛋白(SsCLP)作为抗疥螨疫苗蛋白进行免疫实验，结果显示疥螨几丁质酶样蛋白具有强反应性和良好的免疫原性，并表现出对动物明显的免疫保护作用，成为疥疮的防控新措施，特别是在疥螨引发的兔疥疮中。

【技术实现步骤摘要】
疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的应用。
技术介绍
疥疮是一种由疥螨(Sarcoptesscabiei)引起的高度接触性传染的寄生虫病，对全球人类和动物的健康构成巨大威胁，临床症状包括皮肤炎症，皮疹，瘙痒和皮肤痂皮增厚，在病程后期动物会发生消瘦。疥螨宿主广泛，感染发生在100多种哺乳动物中。疥疮在社会弱势群体广泛存在，如土着居民和发展中国家贫困的地区。疥螨病不受控制的传播引发了严重的死亡率，这对动物福利和经济损失具有重大影响。此外，在热带气候下，经常发生化脓性链球菌或金黄色葡萄球菌感染，导致严重的皮肤脓皮病。目前，杀螨剂是用于控制螨虫的有效途径。然而，杀螨剂的耐药性及其毒性可能会阻碍其发展。此外，杀螨剂残留物对健康有害并对环境构成威胁。相比之下，有效的抗螨疫苗在安全性，环境友好性和经济成本方面都将会更有优势，能更有效地保护人和动物。疥螨入侵可诱导宿主的先天性和适应性免疫反应。据报道，疥螨感染动物后可诱发宿主产生保护性免疫。这些发现表明将来有可能开发一种控制疥螨的疫苗。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白的新应用，使得所述基因表达的疥螨几丁质酶样蛋白具有强反应性和良好的免疫原性，可对动物表现出免疫保护作用，应用到相关疫苗的制备中；本专利技术的另外一个目的在于提供含上述疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体和/或其表达的蛋白在制备防治疥疮的疫苗中的应用；本专利技术的另外一个目的在于提供利用上述蛋白制备的防治疥疮的疫苗。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白在制备防治疥疮的疫苗中的应用。本专利技术根据疥螨基因组学数据(基因登录号：JXLN01012673.1)与疥螨蛋白组学数据(基因登录号：KPM08736.1)，确定了疥螨一个疥螨几丁质酶样蛋白(SsCLP)基因，序列如SEQIDNO:1所示，DNA全长序列长1701bp，包含一个1251bp的开放阅读框(ORF)，编码416个氨基酸残基的蛋白。本专利技术选取SsCLP核苷酸457位至1251位作为目标蛋白的表达基因，其包含一个795bp的ORF(SEQIDNO:2所示)，编码一个264个氨基酸残基的蛋白(30.9kDa，序列如SEQIDNO:3所示)，pI为8.92，该蛋白无信号肽和跨膜结构域，且具有较强的亲水性。系统发育分析表明，该SsCLP基因被归为第五分支，该序列与埋内欧尘螨(Euroglyphusmaynei)CLP具有较高的同源性(图1)。本专利技术通过体外重组技术获得了含SEQIDNO:2所示序列的重组载体(SEQIDNO:2所示序列+基础载体序列)，并进一步获得了重组蛋白rSsCLP(49kDa，SEQIDNO:3所示氨基酸+基础载体表达的氨基酸)，自然感染S.scabiei的兔血清样品和抗rSsCLP兔血清样品都能识别抗原rSsCLP蛋白，显示大小49kDa蛋白信号条带，表明SsCLP重组蛋白具有强反应性和良好的免疫原性。健康兔血清样品无法识别抗原蛋白信号。以自然感染S.scabiei的兔血清样品识别疥螨粗提取物作为内参，结果显示大小45kDa(416个氨基酸残基)蛋白质信号。同时，使用纯化后的rSsCLP蛋白在三个实验组中进行疫苗免疫实验，设置对照组分别免疫PBS，QuilA皂苷或空基础载体蛋白。结果显示rSsCLP具有强反应性和良好的免疫原性。使用rSsCLP免疫后，实验组中有74.3％(26/35)的兔表现出免疫保护作用，并且与无疥螨感染兔相比没有显着差异；炎症反应和病变区域的等级显示，感染4周后三个实验组和三个对照组之间存在显着差异，随着感染时间的延长差异更加明显；在体重方面，实验组体重增加，而对照组体重减轻；感染4周后，与三个对照组相比，三个免疫rSsCLP蛋白的实验组中的病变面积显著减少。结果表明，rSsCLP是一个良好的抗螨疫苗候选蛋白分子。此外，在抗体反应实验中，QuilA皂苷和PBS对照组的IgG水平没有明显变化，并且在免疫前后维持相对稳定的低水平。空基础载体蛋白组在第二次免疫后2周时抗体水平达到峰值。然而，抗体水平在短时间后迅速下降，没有保护作用，表明基础载体蛋白对rSsCLP的免疫作用和特异性抗体的产生没有影响。在三个免疫rSsCLP组中，用rSsCLP进行第二次免疫后2周抗体水平达到最高值，并且抗体水平可持续较长时间。上述各种试验结果是本专利技术提出疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白在制备防治疥疮的疫苗中的应用的依据，这是本专利技术提出的第一个应用。同样根据试验可知，含疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体和/或其表达的蛋白同样可应用在制备防治疥疮的疫苗中，这是本专利技术提出的另一个应用。两个应用中，所述疥螨几丁质酶样蛋白基因如SEQIDNO:1所示或如SEQIDNO:2所示，所述疥螨几丁质酶样蛋白基因表达的蛋白如SEQIDNO:3所示，或为由SEQIDNO:1所示基因序列表达的蛋白。在本专利技术具体实施方式中，所述重组载体为含疥螨几丁质酶样蛋白基因的pET-32a(+)表达载体。本专利技术还提供了一种疥疮疫苗，其包括本专利技术第一个应用中的疥螨几丁质酶样蛋白基因表达的蛋白和免疫佐剂；或者包括本专利技术第二个应用中的含疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体表达的蛋白和免疫佐剂。在本专利技术具体实施方式中，所述免疫佐剂为皂苷溶液，所述皂苷的浓度为1mg/mL；更具体地，皂苷为QuilA皂苷，皂苷溶液为皂苷的PBS溶液。作为优选，疫苗中所述疥螨几丁质酶样蛋白基因表达的蛋白浓度或含疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体表达的蛋白浓度为100-200μg/mL。由以上技术方案可知，本专利技术以疥螨几丁质酶样蛋白(SsCLP)作为抗疥螨疫苗蛋白进行免疫实验，结果显示疥螨几丁质酶样蛋白具有强反应性和良好的免疫原性，并表现出对动物明显的免疫保护作用，成为疥疮的防控新措施，特别是在疥螨引发的兔疥疮中。附图说明图1所示为SsCLPs和其他物种CLPs之间的无根系统发育树；图2所示为重组SsCLP(rSsCLP)的SDS-PAGE和免疫印迹；其中，M，蛋白质分子量标记(kDa)；1，Pet-32a(+)空载体蛋白；2，未纯化的重组SsCLP蛋白；3，纯化后重组SsCLP蛋白；4，疥螨粗提取物；5，自然感染疥螨兔血清(用0.01MPBS1:100稀释)特异结合纯化后重组SsCLP蛋白(实验组)；6，抗SsCLP蛋白兔血清(用0.01MPBS1:100稀释)特异性结合重组SsCLP蛋白(阳性对照)；7，未感染疥螨兔血清(用0.01MPBS1:100稀释)识别纯化后重组SsCLP蛋白(阴性对照)；8，抗SsCLP蛋白兔血清(用0.01MPBS1:100稀释)特异性结合疥螨粗提取物；实验中，所有蛋白样品来源相同，凝胶/印迹的样品进行了平行处理，同时进行了剪切；图3所示为攻虫前与攻虫4周后兔后肢临床症状；A排显示兔正常的后肢；B排显示疥螨感染4周后兔后肢临床症状；PBS：两次分别用1mL0.01MPBS免疫；QuilA：两次分别用1mL浓度为1mg/mL的QuilA皂苷(溶于PBS)免疫；vectorprotein：分别用100本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白在制备防治疥疮的疫苗中的应用。

【技术特征摘要】
1.疥螨几丁质酶样蛋白基因和/或其表达的蛋白在制备防治疥疮的疫苗中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述疥螨几丁质酶样蛋白基因如SEQIDNO:1所示或如SEQIDNO:2所示。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述疥螨几丁质酶样蛋白基因表达的蛋白如SEQIDNO:3所示，或为由SEQIDNO:1所示基因序列表达的蛋白。4.含疥螨几丁质酶样蛋白基因的重组载体和/或其表达的蛋白在制备防治疥疮的疫苗中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述重组载体为含疥螨几丁质酶样蛋白基因的pET-32a(+)表达载体。6.根据权利要求4或5所述应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光友，沈能兴，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51