赭曲霉毒素A半抗原、人工抗原及其制备方法、试剂盒及赭曲霉毒素A的检测方法技术

本发明专利技术提供一种赭曲霉毒素A半抗原、人工抗原及其制备方法、试剂盒及赭曲霉毒素A的检测方法，所述赭曲霉毒素A半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：

【技术实现步骤摘要】
赭曲霉毒素A半抗原、人工抗原及其制备方法、试剂盒及赭曲霉毒素A的检测方法
本专利技术涉及酶联免疫检测技术，特别是涉及赭曲霉毒素A半抗原、人工抗原及其制备方法、试剂盒及赭曲霉毒素A的检测方法。
技术介绍
赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)由曲霉和青霉两类霉菌产生，常污染食品和饲料。赭曲霉毒素A能引起动物急性和慢性中毒，是强致癌物质，可对肾脏造成不可逆的致死毒害，引起肾脏萎缩，还可使胎儿畸形、流产甚至死亡，严重影响动物的机能和生长状况，其对人类的潜在危害备受关注。为此，国际癌症研究机构将其定位为IIB类致癌物，加强对赭曲霉毒素A检测是防止被赭曲霉毒素A污染的食物和饲料直接或间接进入人类食物链的重要方法。1996年，Zimmerli首次检测到赭曲霉毒素A在葡萄酒和葡萄汁中，随后大量的研究证明了葡萄酒中赭曲霉毒素A的存在，其已经成为人类摄取赭曲霉毒素A的第二大来源。目前，检测葡萄酒中赭曲霉毒素A的主要方法有薄层色谱法、高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FD)，以及高效液相色谱-质谱检测法(HPL-CMS)。薄层色谱检测限太低，高效液相色谱-质谱检测法(HPL-CMS)设备较为昂贵，不是所有的检测机构均拥有。因此建立一种快速、准确、方便、实用的检测方法，有利于监控葡萄酒生产过程中赭曲霉毒素A的含量，从而才能保障我国葡萄酒的食品安全与葡萄酒产业的健康发展。
技术实现思路
基于此，有必要针对赭曲霉毒素A，提供一种赭曲霉毒素A半抗原、人工抗原及其制备方法、试剂盒及赭曲霉毒素A的检测方法。一种赭曲霉毒素A半抗原，所述赭曲霉毒素A半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：一种所述的赭曲霉毒素A半抗原的制备方法，包括将所述赭曲霉毒素A和对甲酸苯甲酰氯溶解在有机溶剂中反应。在其中一个实施例中，所述赭曲霉毒素A的量为20～40mg，所述对甲酸苯甲酰氯的量为10～20mL。一种赭曲霉毒素A人工抗原为所述的赭曲霉毒素A半抗原与第一载体蛋白的偶联物。一种赭曲霉毒素A酶联免疫试剂盒，包括所述的赭曲霉毒素A人工抗原为免疫原得到的抗体。在其中一个实施例中，还包括底物显色液，所述底物显色液包括对硝基酚磷酸盐显色液。在其中一个实施例中，还包括包被有包被原的酶标板。在其中一个实施例中，所述包被原包括氯甲酸异丁酯和所述赭曲霉毒素A反应得到的化合物与第二载体蛋白的偶联物。在其中一个实施例中，所述第一载体蛋白和所述第二载体蛋白独立的为BSA、OVA或牛甲状腺球蛋白。一种赭曲霉毒素A的检测方法，包括以下步骤：S1、将待测样品进行前处理；S2、使用所述的赭曲霉毒素A酶联免疫试剂盒对经过所述前处理的所述待测样本进行酶联免疫法检测；以及S3、分析检测结果。上述本专利技术提供的赭曲霉毒素A半抗原，可以通过将所述赭曲霉毒素A和对甲酸苯甲酰氯溶解在有机溶剂中得到。将得到的化合物与载体蛋白连接得到赭曲霉毒素A人工抗原，这种抗原最大程度的保留了赭曲霉毒素A全部官能团结构的特征。所述赭曲霉毒素A人工抗原能够发挥最佳的构效关系优势，从而得到特异性很强的抗体。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，对本专利技术的赭曲霉毒素A半抗原及抗原以及赭曲霉毒素A酶联免疫试剂盒及其检测方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供一种赭曲霉毒素A半抗原，所述赭曲霉毒素A半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：式(Ⅰ)。本专利技术实施例还提供一种赭曲霉毒素A半抗原的制备方法，包括将所述赭曲霉毒素A和对甲酸苯甲酰氯溶解在有机溶剂中反应。本专利技术实施例所述的赭曲霉毒素A半抗原为所述赭曲霉毒素A和所述对甲酸苯甲酰氯溶解在有机溶剂，例如二甲基甲酰胺(DMF)中反应得到。优选的，在反应中添加三乙醇胺作为催化剂，加速反应进度。所述赭曲霉毒素A是小分子物质，其分子量是403.82，属于典型的半抗原。小分子物质在免疫反应中，只具有反应原性而不具有免疫原性，需要与大分子载体蛋白偶联才具有免疫原性，才能刺激机体发生免疫应答，从而产生抗体。因此，增加所述赭曲霉毒素A分子结构与大分子载体蛋白偶联的能力，且不影响其本身的抗原决定簇的结构尤为关键。专利技术人通过大量实验发现，所述对甲酸苯甲酰氯在起到交联剂作用的同时，可防止大分子载体蛋白对半抗原的屏蔽效应，即防止半抗原与载体结合时，抗原决定簇被包埋在卷曲凹陷的大分子结构中，抗原决定簇的完全外露使得所产生的对应抗体的专一性相应增加，进而交叉反应减少。半抗原或其衍生物结构中末端的活性基团如-NH2、-COOH为间隔臂，与载体蛋白偶联合成完全抗原。因此，所述对甲酸苯甲酰氯为所述赭曲霉毒素A分子引入羧基官能团的同时，对所述赭曲霉毒素A分子抗原决定簇的结构没有影响。优选的，取20～40mg的所述赭曲霉毒素A和10～20mL所述对甲酸苯甲酰氯，溶解在所述二甲基甲酰胺(DMF)中。进一步优选的，取30mg的所述赭曲霉毒素A和15mL所述对甲酸苯甲酰氯溶解在所述二甲基甲酰(DMF)中反应，同时添加三乙醇胺作为催化剂，得到所述赭曲霉毒素A半抗原。本专利技术实施例还提供一种赭曲霉毒素A人工抗原，为所述的赭曲霉毒素A半抗原与第一载体蛋白的偶联物。优选的，本专利技术实施例所述的赭曲霉毒素A人工抗原的制备方法包括：采用活化酯法预处理所述赭曲霉毒素A半抗原；以及将预处理后的所述赭曲霉毒素A半抗原与第一载体蛋白偶联。采用活化酯法预处理所述赭曲霉毒素A半抗原即对所述赭曲霉毒素A半抗原的羧基进行酯化，进一步优选的，所述赭曲霉毒素A半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N-二环已基碳化二亚胺(DCC)溶于二甲基甲酰胺(DMF)中反应，更进一步优选的，取20～40mg所述赭曲霉毒素A半抗原与10～20mlN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N-二环已基碳化二亚胺(DCC)反应。上述反应过程在室温避光并持续搅拌10～12h条件下进行。优选的，上述反应过程在室温黑暗环境下持续搅拌11h，黑暗环境下，反应更加完全。酯化后的反应液加入到含有第一载体蛋白的溶液中，所述第一载体蛋白中的氨基与被酯化后的所述赭曲霉毒素A半抗原通过化学键偶联形成偶联物，即得到赭曲霉毒素A人工抗原。所述第一载体蛋白，可以是天然蛋白质、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、兔血清白蛋白(RSA)、卵清白蛋白(OVA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、纯化的重组蛋白、人工合成多肽、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔戚血蓝蛋白(KnoweyholeLimpetHemocyanin，KLH)、多价抗原肽(MAP，主要指多聚Lys)中的一种，也可以是人工蛋白、酶、多肽或聚合物。优选的为牛甲状腺球蛋白。本专利技术实施例还提供一种赭曲霉毒素A酶联免疫试剂盒，包括以所述赭曲霉毒素A人工抗原为免疫原得到的抗体。所述抗体优选以一抗工作液的形式提供。具体的，所述一抗工作液的制备方法包括：以所述赭曲霉毒素A人工抗原为免疫原免疫非哺乳动物得到抗血清，从所述抗血清中纯化得到所述赭曲霉毒素A多克隆抗体，将所述赭曲霉毒素A多克隆抗体按照一定比例稀释形成稀释液，即得到所述一抗工作液。所述非哺乳动物可以为兔、羊、鼠、豚鼠或马等。优选的，所述赭曲霉毒素A酶联免疫试本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种赭曲霉毒素A半抗原，其特征在于，所述赭曲霉毒素A半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：

【技术特征摘要】
1.一种赭曲霉毒素A半抗原，其特征在于，所述赭曲霉毒素A半抗原的化学结构式(Ⅰ)如下：2.一种根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A半抗原的制备方法，包括将所述赭曲霉毒素A和对甲酸苯甲酰氯溶解在有机溶剂中反应。3.根据权利要求2所述的赭曲霉毒素A半抗原的制备方法，其特征在于，所述赭曲霉毒素A的量为20～40mg，所述对甲酸苯甲酰氯的量为10～20mL。4.一种赭曲霉毒素A人工抗原，其特征在于，为根据权利要求1所述的赭曲霉毒素A半抗原与第一载体蛋白的偶联物。5.一种赭曲霉毒素A酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括以权利要求2所述的赭曲霉毒素A人工抗原为免疫原得到的抗体。6.根据权利要求5所述的赭曲霉毒素A酶联免疫试剂盒，其特征在于，还包括底物显色液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆鹏杰，陈霞，周爽，赵云峰，李敬光，张霁月，
申请(专利权)人：国家食品安全风险评估中心，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京,11