本发明专利技术涉及一种糖基转移酶UGTE1及编码该糖基转移酶的基因，以及包含所述糖基转移酶编码基因的载体和重组细胞，利用所述糖基转移酶可以催化糖苷配基(或称底物或目标化合物)与糖基供体发生糖基化反应生成糖苷。
【技术实现步骤摘要】
一种糖基转移酶UGTE1、其编码基因和应用
本专利技术涉及一种糖基转移酶及其该糖基转移酶的编码基因，以及该糖基转移酶在糖苷类化合物生产中的应用，植物基因工程领域。
技术介绍
化学法和酶法是目前进行糖基化修饰、糖苷合成的两大方法，糖类分子上多个可以反应的羟基，使得化学法糖基化必须进行复杂的基团保护剂糖苷合成后的去保护，才能在立体构象和区域位置上特异性合成糖苷键，如此频繁的步骤大大限制了其工业化合成糖胺的实用性。相比而言，酶法糖基化具有立体选择性和区域选择性，步骤简单，环境污染也更小。糖基转移酶是一种能够能催化活化的糖供体到受体分子上而形成糖苷键的酶(CarbohydrateActiveEnzymes；http://www.cazy.org)。常见的糖基供体有：葡萄糖，木酮糖，果糖，葡萄糖醛酸；常见的糖基受体有：氧基团，碳基团，氮基团，硫基团。植物中，糖基化反应经常出现在化合物生物合成中的最后步骤中，糖基化反应几乎发生在所有类型的化合物中，例如萜类，黄酮类，类胡萝卜素，氰醇类。糖基化作用能增加化合物的水溶性并减小毒副作用。根据GT氨基酸序列相似性、形成糖苷的立体化学结构和已知底物的特异性，目前已将其分为105个已编号的家族，但不同家族间的进化关系仍并不清楚，由于GT1中很多GT的C末端含有1个由44个氨基酸组成的保守序列，因此将GT1单独归为一个尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)超家族，其成员主要以UDP-葡萄糖和UDP-葡糖醛酸为糖基供体，该保守序列被认为是结合糖基供体的区域；而不含保守序列的GT归为另一个家族，其成员较少，其中的植物源GT催化固醇和甘油酯类的糖苷化。根据糖基转移酶的构型可以将其分为GT-A，GT-B和GT-C三种构型，根据GT催化反应机制，可将其分为“转化型”和“保留型”。
技术实现思路
本专利技术第一个方面，涉及一种分离的糖基转移酶UGTE1(或称雷公藤糖基转移酶，TwUGTE1)，其中所述酶：(1)包含SEQIDNO：2所示的氨基酸序列；或(2)由包含SEQIDNO：1所示核苷酸序列编码的多肽；或(3)与上述(1)或(2)限定的酶同源；或(4)由一核酸编码，所述核酸在严格条件下与SEQIDNO：1的核苷酸序列或其互补链杂交的多核苷酸所编码的多肽；或(5)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸且功能相同的多肽。术语“糖基转移酶”表示能够从活化的核苷酸糖转移到糖苷配基以形成糖苷的糖基转移酶。当糖基转移酶通过O-糖苷键缀合糖到糖苷配基，可以称其为O-糖基转移酶。术语“糖苷配基”表示糖苷配基的相应糖基化形式的非碳水化合物部分。当糖是葡萄糖时，可以将糖苷配基称为配基，此外，当糖是葡萄糖时，术语葡糖化可以代替糖基化使用。当糖苷配基在羟基处糖基化时，通常产生所谓的O-糖苷键，即所谓的O-糖苷(或者，如果糖是葡萄糖，则为O-葡萄糖苷)。术语“分离的酶”在本文中本质上涉及的是一种多肽从其天然环境中分离。如SEQIDNO：2所示的糖基转移酶雷公藤植物细胞中分离，或者从重组大肠杆菌细胞表达后的产物中分离。“分离的酶”是指这样的多肽制备物，所述多肽制备物以重量计，含有至少20％纯度，优选至少40％纯度，更有选至少60％纯度，甚至更优选至少80％纯度，最优选至少90％纯度，并且甚至最优选至少95％纯度的多肽，如通过SDS-PAGE测定的纯度。在提及核酸、蛋白或肽时，本文所用的术语“同源性”是指，一个核酸与另一核酸在其核苷酸序列上实质相同或相似，或蛋白或肽与另一种蛋白或肽在其氨基酸序列上实质相同或相似，但与比较的核酸或蛋白或肽并不完全相同。两个核酸或蛋白或肽之间的同源性的存在可以通过以下方式来确定：比较第一序列中的位置与第二序列中的对应位置，从而确定在该位置是否存在相同或相似的残基。当存在某一最小百分比的相同或相似的核酸或氨基酸时，两条比较的序列彼此同源。统一性表示在等同位置比较两条序列时，存在相同的核苷酸或氨基酸。任选地，可能有必要考虑序列空位以便产生可能的最佳对比。相似的氨基酸或具有相同或同等化学和/或物理性质的非相同氨基酸。用具有相同或同等化学和/或物理性质的另一氨基酸替换氨基酸被称为“保守取代”。氨基酸的物理化学性质实质是疏水性或电荷，就核酸而言，当编码序列中密码子内的一个核苷酸被替换为另一核苷酸时，其称为相似核苷酸或保守取代，新密码子例如由于遗传密码的简并性，仍然编码相同或相似的氨基酸。本领域技术人员知晓哪些核苷酸或氨基酸取代是保守取代在提到互补核酸的配对时，本文实用了术语“杂交”。杂交和杂交的强度(即，核酸之间的关联强度)受到以下因素的影响，如核酸之间的互补程度，涉及的条件的严格性，形成的杂交体的核酸的Tm(熔解温度，和核酸内的G:C比)等。术语“杂交”涉那个的及多核苷酸在至少中等严格调价与SEQIDNO：1的核苷酸的互补链杂交，涉及核苷酸序列在中等严格条件下与对应于SEQIDNO：1所示的核苷酸序列或其互补链的标记核酸探针杂交。使用比如X射线胶片可以检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。本领域有关杂交严格条件是本领域技术人员通常会理解有关的严格条件，即，对于中等严格条件，技术人员会理解的条件是中等严格条件。技术人员知道有关的杂交严格条件，见例如(J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManul,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。根据本领域对于长度为至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃下5XSSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切和变性的鲑精DNA预杂交和杂交，以及25％甲酰胺对应非常低和低严格性，35％甲酰胺对应中和中-高严格性或50％甲酰胺对应高和非常高严格性，之后进行标准Southern印记程序12至24小时最佳。对应长度为至少100个核苷酸的长探针，所述载体材料最终洗涤三次，每次用2×SSC0.2％SDS洗涤15分钟，优选至少在45℃，(非常低严格性)，更优选至少在50℃(低严格性)，更优选至少在55℃(中等严格性)，更优选至少在60℃(中-高严格性)，甚至更优选至少在65℃(高严格性)，并且最优选至少在70℃(非常高严格性)。在本专利技术的第二个方面，本专利技术还涉及第一方面的酶的片段，其中所述片段包含所述酶至少60，优选至少65、70、75、80、85、90、100、110、120、150、180、200、240、270、300、350、400、450、480或至少500个连续氨基酸，并且其中所述片段催化糖基配体与目标化合物糖基化。在第三个方面，本专利技术涉及编码本专利技术第一方面的酶或本专利技术第二方面的片段的核酸，优选地，所述核酸为如下中的至少一种：(1)SEQIDNO：1所示的核苷酸分子；或(2)SEQIDNO：1所示的核苷酸分子经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列；或(3)在严格条件下与SEQIDNO：1所示核苷酸分子杂交的核苷酸序列，所述严格条件为：在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％的SDS的0.1×SSC溶液中杂交。本专利技术的一个实施方案中，提供了编码本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的糖基转移酶，所述酶(1)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或(2)由包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码；或(3)与上述(1)或(2)限定的酶同源；或(4)由一核酸编码，所述核酸在严格条件下与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补链杂交的多核苷酸所编码的多肽；或(5)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸且功能相同的多肽。
【技术特征摘要】
1.一种分离的糖基转移酶，所述酶(1)包含SEQIDNO：2所示的氨基酸序列；或(2)由包含SEQIDNO：1所示核苷酸序列编码；或(3)与上述(1)或(2)限定的酶同源；或(4)由一核酸编码，所述核酸在严格条件下与SEQIDNO：1的核苷酸序列或其互补链杂交的多核苷酸所编码的多肽；或(5)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸且功能相同的多肽。2.权利要求1所述酶的片段，其中所述片段具有权利要求1所述酶活性。3.编码权利要求1所述酶或权利要求2所述的片段的核酸。4.根据权利要求3所述核酸，所述核酸为如下中的至少一种：(1)SEQIDNO：1所示的核苷酸分子；或(2)SEQIDNO：1所示的核苷酸分子经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列；或(3)在严格条件下与SEQIDNO：1所示核苷酸分子杂交的核苷酸序列，所述严格条件为：在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％的SDS的0.1×SSC溶液中杂交。5...
【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，黄璐琦，马宝伟，苏平，刘喜红，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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