大黄素糖基转移酶蛋白FtUGT75R2及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了大黄素糖基转移酶蛋白FtUGT75R2及其编码基因与应用。该蛋白是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有大黄素6‑O‑葡萄糖苷糖基转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明专利技术主要是基于苦荞基因组，获得大黄素糖基转移酶序列，并通过原核表达重组蛋白，确认FtUGT75R2可以催化大黄素生成大黄素6‑O‑葡萄糖苷。

Emodin glycosyltransferase protein FtUGT75R2 and its coding genes and Application

The invention discloses emodin glycosyltransferase protein FtUGT75R2, its coding gene and application. The protein is a) or b) protein: a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in sequence 2 in the sequence table; b) a protein derived from the amino acid sequence shown in sequence 2 by substitution and/or deletion of one or more amino acid residues and/or addition of emodin 6 O glucosyltransferase with emodin 6 O glucosyltransferase activity. Raw protein. The invention is mainly based on Tartary Buckwheat genome, obtains emodin glycosyltransferase sequence, and expresses recombinant protein through prokaryotic expression, confirms that FtUGT75R2 can catalyze emodin to produce emodin 6_O_glucoside.

【技术实现步骤摘要】
大黄素糖基转移酶蛋白FtUGT75R2及其编码基因与应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及大黄素糖基转移酶蛋白FtUGT75R2及其编码基因与应用。
技术介绍
大黄素(Emodin)化学名为1,3,8-三羟基-6甲基蒽醌(1,3,8-Trihydroxy-6-methylanthraquinone)。分子式为C15H10O5，几乎不溶于乙醇及碱溶液。大黄素是蓼科植物中比较特异的一种化合物，存在于大黄、何首乌和苦荞中，资源丰富，来源十分广泛，并且提取方法和纯化工艺相对简单。药理实验研究表明，大黄素具有抑菌、泻下、利尿、解痉、抗炎、止咳、抗肿瘤的作用，同时，临床上还有利于治疗Ⅱ型糖尿病，在减肥等保健品上应用广泛。但由于大黄素水溶性差，极大地制约了大黄素的推广和应用。大黄素经过糖基化修饰后，不仅可以极大地提高其可溶性，还可以增强其药效。大黄素6-O-葡萄糖苷被Lee等报道能够下调内皮细胞蛋白C受体脱落和抑制高糖诱导的实验研究血管炎症，因此它可以被用作治疗血管性炎症的治疗疾病候选药物，同时，对糖尿病并发症和动脉粥样硬化有显著的治疗益处。大黄素8-O-葡萄糖苷可用于制备预防或治疗老年痴呆症的药物或食品，对脑内真正的乙酰水解酶有良好的可逆抑制作用，对β淀粉样蛋白引起的神经损伤有一定的保护作用，还可以改善东莨菪碱所致记忆功能紊乱的能力。以大黄素为基本结构，进行结构修饰以增强大黄素活性，扩大应用范围是一项重要的研究工作。对大黄素进行结构修饰，国内外已有许多研究报道。目前大黄的结构修饰主要采用化学方法，得到多个衍生物。谭嘉恒等人以大黄素为母体，在其侧链上设计合成了一类新型含氮的大黄素衍生物，包括叠氮化合物、甲基氨化合物和季铵盐化合物，实验发现，这类衍生物具有良好的抗肿瘤活性。LarsTeich等人以大黄素作为原料，结构修饰后，获得了8个衍生物，研究发现1，3，8三羟基-6-甲基蒽醌具有很强的抗肿瘤活性。Demirezer等人发现大黄素及其衍生物，对多种肿瘤细胞有抑制作用。张弘等人在实验室内以天然存在的大黄素为原料合成了甲基化衍生物大黄素甲醚和三甲氧基大黄素，并进行了杀菌和杀虫活性研究，发现3个蒽醌类化合物对黄瓜白粉的活性有明显差异。应用化学方法进行结构修饰存在选择性不强，副产物多，后期分离困难，设备投资大，技术要求高，大量使用有机溶剂，存在环境污染的隐患。现在也有利用微生物法来获得大黄素修饰物的报道。早在2004，研究人员利用兰色犁头霉对大黄素进行糖基化修饰，最终获得大黄素-糖苷混合物，其中包括大黄素6-葡萄糖苷和大黄素8-葡萄糖苷。Ghimire等利用地衣芽孢杆菌DSM13中的Glycosyltransferase(YjiC)对大黄素进行体外酶促修饰，结果表明，YjiC具有催化大黄素等芳香族化合物糖基化，形成大黄素糖苷混合物的能力。综上，大黄素糖苷的修饰，化学法污染大，成本高，而现有的微生物法或酶法，产物不纯，分离成本高。虽然现在已有大黄素糖苷生物或化学合成的报道，但这些方式存在或者环境非友好型的问题，或者目标产物多样性的问题。因此，亟待一种特异性高的酶，来特异合成单一的大黄素糖苷。
技术实现思路
为了弥补以上领域的不足，本专利技术基于苦荞(Fagopyrumtataricum)基因组数据，用反向遗传学的方法找到并鉴定大黄素6-O-葡萄糖苷合成的特异糖基化修饰酶FtUGT75R2，为生物合成大黄素6-O-葡萄糖苷提供了大黄素6-O-葡萄糖苷糖基转移酶蛋白及其编码序列和转基因实验基础。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有大黄素6-O-葡萄糖苷糖基转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。所述大黄素6-O-葡萄糖苷糖基转移酶活性是催化大黄素生成大黄素6-O-葡萄糖苷的活性。所述蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。将该基因命名为FtUGT75R2，将其编码的蛋白命名为FtUGT75R2。具体信息如下：FtUGT75R2基因序列如序列表中序列1所示，序列表中序列1自5’末端第1位到第1476位为开放阅读框，开放阅读框部分为1476bp，其编码序列表中序列2所示的蛋白，序列2由491个氨基酸组成。含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。扩增所述编码基因全长或其任一片段的引物也属于本专利技术的保护范围，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。所述的蛋白在作为大黄素6-O-葡萄糖苷糖基转移酶中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述大黄素6-O-葡萄糖苷糖基转移酶是催化大黄素生成大黄素6-O-葡萄糖苷的酶。所述的蛋白、所述编码基因在催化大黄素生成大黄素6-O-葡萄糖苷中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术主要是基于苦荞基因组，获得大黄素糖基转移酶序列，并通过原核表达重组蛋白，确认FtUGT75R2可以催化大黄素生成大黄素6-O-葡萄糖苷。附图说明图1为重组载体pMAL-c2X-FtUGT75R2的鉴定结果；其中，pMal为pMalc2x。图2为表达菌株Novablue中重组载体转化子鉴定结果；其中，pMal为pMalc2x。图3为FtUGT75R2重组蛋白SDS-Page胶图；其中，75R2为FtUGT75R2，M代表Maker。图4为FtUGT75R2对大黄素催化活性鉴定UPLC图；E表示大黄素；Product代表大黄素糖苷。图5为FtUGT75R2对大黄素催化产物MS鉴定图；大黄素1-O-G、大黄素8-O-G和产物分别代表大黄素1-O-葡萄糖苷、大黄素8-O-葡萄糖苷和FtUGT75R2催化产物。具体实施方式实施例1、克隆大黄素糖基转移酶的编码基因一、基因克隆的方法和步骤收集苦荞(晋荞2号，为贵州师范大学陈庆富教授提供，记载过晋荞2号的非专利文献是：黎瑞源，石桃雄，陈其皎，潘凡，陈庆富(2017)中国35个苦荞审定品种EST-SSR指纹图谱构建和遗传多样性分析，植物科学学报，35,267-275.)的叶和种子，提取RNA，反转录为cDNA，设计引物序列(如表1)，以叶和种子的混合cDNA为模板，利用KOD高保真酶克隆到FtUGTs基因片段(KOD高保真酶PCR体系总体积为50μL：5μL10ⅩBuffer，3μLMgSO4，5μLdNTP(2mM)，5μL引物(10mM)，1μL模板和8μL水，程序如表2)。借助pEASY-Blunt载体(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CB111-01(20rxns))，成功将FtUGTs片段连入载体上(连接体系总体积为3μL：0.5μLMixBufferwithenzyme和2.5μL模板，25℃反应30min)。连接体系直接转化TransT1感受态(购自北京全式金生物技术有限公司)，挑选阳性克隆测序(菌落PCR体系总体积本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有大黄素6‑O‑葡萄糖苷糖基转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有大黄素6-O-葡萄糖苷糖基转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述大黄素6-O-葡萄糖苷糖基转移酶活性是催化大黄素生成大黄素6-O-葡萄糖苷的活性。3.权利要求1或2所述蛋白的编码基因。4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈士林，尹青岗，孙伟，韩小燕，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11