参与新穿心莲内酯生物合成的糖基转移酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种参与新穿心莲内酯生物合成的糖基转移酶及其编码基因与应用。本发明专利技术提供的蛋白质，获自穿心莲，是如下(a1)或(a5)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a5)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明专利技术还保护所述蛋白质作为糖基转移酶的应用。糖基转移酶参与植物生长、发育及次生代谢过程。糖基转移酶及其编码基因的发现具有重要意义，本发明专利技术为进一步阐明穿心莲中糖苷类化合物的生物合成提供基础，有助于对于穿心莲中糖苷类活性成分的生物合成途径的解析，为新药研发提供了新的物质基础和基因资源。

【技术实现步骤摘要】
参与新穿心莲内酯生物合成的糖基转移酶及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种参与新穿心莲内酯生物合成的糖基转移酶及其编码基因与应用。
技术介绍
穿心莲为爵床科植物穿心莲(Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees)的干燥地上部分，具有清热解毒、凉血、消肿等功效，被广泛用于临床。目前穿心莲除作为中药饮片穿心莲用于临床，还被制成多种现代剂型用于临床，如穿心莲片、穿心莲胶囊、穿心莲注射液、喜炎平注射液及穿琥宁注射液等。其有效成分主要通过化学方法提取，产量较低。与化学合成方法相比，生物合成避免了使用重金属、有机溶剂等对环境造成的污染，酶的底物特异性可以减少副产物的生成，由于天然产物生物合成途径已知，弥补了复杂结构的化合物较难建立化学合成路径的缺陷。穿心莲内酯及其类似物属于二萜内酯类化合物，其生物合成途径主要分为三个阶段，即二萜类化合物直接前体香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的形成阶段、二萜母核的形成阶段、结构修饰酶对二萜结构母核的修饰阶段。GGPP的直接前体IPP和DMAPP主要涉及MEP途径和MVA途径；随后在二萜合酶的作用下，经过最初的离子化、异构化后环化形成各种阳离子中间产物，最终通过去质子或捕获亲核物质进一步环化形成一系列的二萜骨架中间体；随后在通过细胞色素P450进行结构修饰，主要包括羟基化、甲基化、异构化、脱甲基化、加成和还原等。糖基化是一种广泛存在于植物中的重要后修饰及转化反应，是二萜类化合物合成的最后也是极其关键的一步。穿心莲内酯苷具有抗癌、抗病毒、抗微生物和抗炎活性等药理作用，新穿心莲内酯可抗病毒、抗炎、抗氧化、抗寄生虫、保肝。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种参与新穿心莲内酯生物合成的糖基转移酶及其编码基因与应用。本专利技术提供的蛋白质，获自穿心莲，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)含有(a1)的融合蛋白；(a3)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a5)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。标签具体如表1所示。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDLHA9YPYDVPDYA蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。蛋白质的编码基因可通过将(b1)或(b2)中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白质的基因也属于本专利技术的保护范围。所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)所述的DNA分子：(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；(b2)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码糖基转移酶的DNA分子；(b4)来源于穿心莲的与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有95％以上同源性且编码糖基转移酶的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌均属于本专利技术的保护范围。所述重组表达载体具体可为将所述基因克隆至出发表达载体得到的重组质粒。所述出发表达载体具体可为载体HIS-MBP-pET28a。所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌Transetta(DE3)。本专利技术还保护所述蛋白质作为糖基转移酶的应用。本专利技术还保护所述蛋白质的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)：(c1)参与新穿心莲内酯生物合成；(c2)制备新穿心莲内酯；(c3)以新穿心莲内酯苷元为底物制备新穿心莲内酯。本专利技术还保护所述蛋白质的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)：(d1)参与穿心莲内酯苷生物合成；(d2)制备穿心莲内酯苷；(d3)以穿心莲内酯为底物制备穿心莲内酯苷。本专利技术还保护所述蛋白质的应用，为如下(e1)或(e2)或(e3)：(e1)参与脱水穿心莲内酯苷生物合成；(e2)制备脱水穿心莲内酯苷；(e3)以脱水穿心莲内酯为底物制备脱水穿心莲内酯苷。本专利技术还保护所述蛋白质的应用，为如下(f1)或(f2)或(f3)：(f1)参与去氧穿心莲内酯苷生物合成；(f2)制备去氧穿心莲内酯苷；(f3)以去氧穿心莲内酯为底物制备去氧穿心莲内酯苷。本专利技术还保护所述重组菌在制备所述蛋白质中的应用。糖基转移酶参与植物生长、发育及次生代谢过程。糖基转移酶及其编码基因的发现具有重要意义，本专利技术为进一步阐明穿心莲中糖苷类化合物的生物合成提供基础，有助于对于穿心莲中糖苷类活性成分的生物合成途径的解析，为新药研发提供了新的物质基础和基因资源。附图说明图1为底物为穿心莲内酯时的结果图。图2为底物为新穿心莲内酯苷元的结果图。图3为底物为去氧穿心莲内酯的结果图。图4为底物为脱水穿心莲内酯的结果图。图5为以新穿心莲内酯苷元为底物时蛋白作为糖基转移酶的动力学的结果图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。大肠杆菌Transetta(DE3)：北京全式金生物技术有限公司。pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblyKit：北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司。Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱：Qiagen,Wisconsin,USA。穿心莲内酯(CAS号：5508-58-7)、脱水穿心莲内酯(CAS号：134418-28-3)、去氧穿心莲内酯(CAS号：79233-15-1)：四川维克奇生物科技有限公司。新穿心莲内酯苷元(CAS号：82209-74-3)：加拿大TRC公司。穿心莲内酯苷(CAS号：82209-76-5)：上海源叶生物科技有限公司。新穿心莲内酯(CAS号：27215-14-1)：四川维克奇生物科技有限公司。载体HIS-MBP-pET28a记载于如下文献：ProbingtheSingleKeyAminoAcidResponsiblefortheNovelCatalyticFunctionofent-KaureneOxidaseSupportedbyNADPH-CytochromeP450ReductasesinTripterygiumWilfordii；FrontiersinPlantScience，www.frontiersin.org；October2017，Volume8，Arti本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)含有(a1)的融合蛋白；(a3)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a5)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)含有(a1)的融合蛋白；(a3)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a5)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)所述的DNA分子：(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；(b2)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码糖基转移酶的DNA分子；(b4)来源于穿心莲的与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有95％以上同源性且编码糖基转移酶的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，高伟，李媛，王健，苏平，张芮乾，马宝伟，李新林，高杰，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11