一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法技术

本发明专利技术公开了一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其包括对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；HPLC法分析测定和标准曲线法计算含量。本发明专利技术通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、色谱柱、洗脱程序、检测波长、柱温等色谱条件，优选得到最佳的检测条件。本发明专利技术提供的检测方法，测定快速、准确可靠，专属性强，重现性好，可同时检测六神丸中蟾蜍二烯内酯类9种成分，可用于六神丸的质量控制，对控制药品质量具有重要的意义。

A detection method of Liushenwan toad diene lactone

The invention discloses a detection method of toad Liushenwan diene lactone, which comprises preparing a reference solution; for sample preparation; HPLC determination and standard curve method to calculate the content of. Through a large number of experiments, the optimum chromatographic conditions of the mobile phase composition, chromatographic column, elution procedure, detection wavelength and column temperature are screened out, and the optimum detection conditions are preferably obtained. The method provided by the invention, determination of fast, accurate and reliable, strong specificity, good reproducibility, can simultaneously detect bufadienolide Liushenwan in 9 kinds of components, can be used for quality control of Liushenwan, has important significance to control the quality of drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法
本专利技术涉及一种中药制剂的检测方法，具体涉及六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，属于中药成分分析领域。
技术介绍
六神丸由麝香、牛黄、蟾酥等中药组成，属于国家中药保护品种，具有清凉解毒，消炎止痛的功效，适用于烂喉丹痧，咽喉肿痛，喉风喉痈，单双乳蛾，小儿热疖，痈疡疔疮，乳痈发背，无名肿毒。其中所含药味蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍B.melanostictusSchneider的干燥分泌物，其性味甘辛、温，有毒，具有解毒、消肿、醒神、开窍、强心和止痛等作用。根据文献报道，蟾酥主要活性成分为蟾蜍二烯内酯类化合物，该类化合物具有显著的洋地黄样作用、升压、呼吸兴奋和抗肿瘤作用。现有文献报道中，已有学者采用紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法对蟾酥及其制剂中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基进行了定量分析，但未见对和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒等其它蟾酥二烯内酯类化合物同时测定的报道。六神丸目前执行标准为《卫生部药品标准中药成方制剂第十八册》(标准编号：WS3-B-3374-98)，标准中含量测定项中只有牛黄中胆酸的含量测定项。学术论文(邹瑾丽,祁海宏.HPLC法测定六神丸中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量[J].中国临床药学杂志,2007,16(1):49-50.)公开了一种同时测定六神丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基两个蟾蜍二烯内酯类成分的含量方法；学术论文(王建,倪坤仪,于如报.六神丸中蟾毒内酯化合物的HPLC分析[J].中国药科大学学报,1991,22(6):372-374.)公开了六神丸中总蟾毒内酯类化合物含量。但由于蟾酥二烯内酯类化合物的极性非常接近，目前色谱条件并没有达到分离蟾酥二烯内酯类化合物的方法，因此现有技术均不能全面反映六神丸中蟾蜍二烯内酯类化合物含量水平，不能很好的控制产品的质量，存在一定的缺陷。蟾酥既是六神丸中有效成分，也是毒性成分，为对六神丸产品中蟾蜍二烯内酯类成分进行全面检测和分析，本专利技术对六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类成分检测方法同时进行了研究，为制定新的质量标准和有效控制产品质量提供科学依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法。该方法能够同时检测极性接近的9种蟾蜍二烯内酯类成分，简便快速、准确可靠，专属性强，重现性好，可用于六神丸产品的质量控制，具有重要的意义。为实现以上目的，本专利技术的技术解决方案是：一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，包括如下步骤：(1)对照品溶液的制备：精密称取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵和蟾毒灵，用甲醇溶解并定容，得到混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：取六神丸适量，研磨粉碎，取粉末适量，精密称定，精密加入醇适量，提取，放冷，用醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，得供试品溶液；(3)测定法：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入HPLC，按标准曲线法测定蟾蜍二烯内酯类成分的含量；色谱条件：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱；检测波长：245nm～360nm；柱温35℃～45℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；进样量5μl～20μl。作为优选方案，六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，步骤(1)对照品溶液的制备：分别取华蟾酥毒基(CAS:470-37-1)、脂蟾毒配基(CAS:465-39-4)、和蟾蜍他灵(CAS:465-11-2)、沙蟾毒精(CAS：464-74-4)、远华蟾毒精(CAS:472-26-4)、去乙酰华蟾毒它灵(CAS:4099-30-3)、蟾毒它灵(CAS:471-95-4)、华蟾毒它灵(CAS:1108-68-5)和蟾毒灵(CAS:465-21-4)对照品适量，精密称定，以甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为华蟾酥毒基468.11μg/ml、脂蟾毒配基331.56μg/ml、和蟾蜍他灵70.39μg/ml、沙蟾毒精257.78μg/ml、远华蟾毒精261.89μg/ml、去乙酰华蟾毒它灵42.96μg/ml、蟾毒它灵214.73μg/ml、华蟾毒它灵366.44μg/ml、蟾毒灵241.56μg/ml的混合对照品储备液；步骤(2)所述的供试品溶液的制备：取六神丸适量，研磨粉碎，过100～200目筛，取粉末约0.1g～0.5g，精密称定，按料液比1︰50～1︰100精密加入体积浓度为70％～100％甲醇或乙醇，密塞，称重，超声(50KHz～100KHz，功率150W～250W)或回流提取30min～120min，放冷，用70％～100％甲醇或乙醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，得供试品溶液。一、提取方法的筛选：本专利技术对提取方法(超声提取、回流提取)、提取溶剂(纯甲醇、90％甲醇、80％甲醇、70％甲醇、乙醇)、提取时间(30min、60min、90min、120min)、料液比等进行了单因素进行考察，筛选出以纯甲醇作为六神丸的提取溶剂，料液比为1︰50，50kHz频率下超声60min，蟾蜍二烯内酯类成分提取率最高。因此，本专利技术优选的提取方法为：取六神丸适量，研磨粉碎，过200目筛，取粉末约0.2g，精密称定，精密加入甲醇10ml(料液比1︰50)，密塞，称重，超声(工作频率50KHz，功率250W)提取60min，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，待测。二、色谱条件的筛选：本专利技术分别对色谱柱、洗脱系统、洗脱程序、柱温、检测波长进行了筛选。1、色谱柱的筛选：分别筛选色谱柱1：XbridgeC18(4.6×250mm,5μm,Waters)；色谱柱2：ODSHypersilC18(4.6×250mm,5μm,Thermo)；色谱柱3：ODS-2C18(4.6×250mm,5μm，汉邦)。根据色谱峰的分离情况，9种蟾蜍二烯内酯类成分在ODS-2C18(4.6×250mm,5μm，汉邦)色谱柱上分离较好，优选色谱柱3：ODS-2C18(4.6×250mm,5μm，汉邦)色谱柱。2、洗脱系统的筛选：本专利技术分别筛选洗脱系统：1：甲醇-水；2：乙腈-水；3：乙腈-0.1％磷酸；4：乙腈-0.15％磷酸；5：乙腈-0.3％磷酸。根据9种蟾蜍二烯内酯类成分色谱峰分离效果和峰型等，优选4：乙腈-0.15％磷酸为最终洗脱系统。3、洗脱程序的筛选：本专利技术以乙腈-0.15％磷酸做流动相，筛选了程序1-5的洗脱程序，以乙腈百分比表示，括号内表示时间(min)：程序1：5％(0)～15％(12)～20％(20)～30％(25)～45％(35)～55％(45)～70％(50)～90％(55)～15％(60)～15％(62)程序2：10％(0)～30％(10)～40％(20)～45％(30)～50％(35)～67％(37)～86％(40)～96％(42)～30％(44)～15％(45)程序3：20％(0)～25％(15)～40％(25)～40％(35)～55％(37)～55％(45)～100％(47)～100％(52)～20％(54)～20％(55)程序4：25％(0)～35％(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其特征在于,包括如下步骤：(1)对照品溶液的制备：精密称取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵和蟾毒灵，用甲醇溶解并定容，得到混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：取六神丸适量，研磨粉碎，取粉末适量，精密称定，精密加入醇适量，提取，放冷，用醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，得供试品溶液；(3)测定法：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入HPLC，按标准曲线法测定蟾蜍二烯内酯类成分的含量；色谱条件：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱；检测波长：245nm～360nm；柱温35℃～45℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；进样量5μl～20μl。

【技术特征摘要】
1.一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其特征在于,包括如下步骤：(1)对照品溶液的制备：精密称取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵和蟾毒灵，用甲醇溶解并定容，得到混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：取六神丸适量，研磨粉碎，取粉末适量，精密称定，精密加入醇适量，提取，放冷，用醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，得供试品溶液；(3)测定法：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入HPLC，按标准曲线法测定蟾蜍二烯内酯类成分的含量；色谱条件：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱；检测波长：245nm～360nm；柱温35℃～45℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；进样量5μl～20μl。2.根据权利要求1所述的一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其特征在于：步骤(1)对照品溶液的制备：分别取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵和蟾毒灵对照品适量，精密称定，以甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为华蟾酥毒基468.11μg/ml、脂蟾毒配基331.56μg/ml、和蟾蜍他灵70.39μg/ml、沙蟾毒精257.78μg/ml、远华蟾毒精261.89μg/ml、去乙酰华蟾毒它灵42.96μg/ml、蟾毒它灵214.73μg/ml、华蟾毒它灵366.44μg/ml、蟾毒灵241.56μg/ml的混合对照品储备液；步骤(2)所述的供试品溶液的制备：取六神丸适量，研磨粉碎，过100～200目筛，取粉末约0.1g～0.5g，精密称定，按料液比1︰50～1︰100精密加入体积浓度为70％～100％甲醇或乙醇，密塞，称重，超声或回流提取30min～120min，放冷，用70％～100％甲醇或乙醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，得供试品溶液。3.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨方钰，狄留庆，王恒斌，严燕青，李俊松，李全，李娟，罗年翠，
申请(专利权)人：雷允上药业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32