本发明专利技术公开了一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，属于酶工程以及蛋白质工程技术领域。本发明专利技术的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体是通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的一个氨基酸位点进行突变，得到了与亲本麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比更高的热稳定性。本发明专利技术的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体在50℃的半衰期比野生型增加41h，是野生型的2倍，即本发明专利技术的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的稳定性较野生型提高了2倍。
A maltooligosaccharide trehalose synthase mutant with improved thermal stability
The invention discloses a maltooligosaccharide trehalose synthase mutant with improved thermal stability, which belongs to the field of enzyme engineering and protein engineering technology. The maltooligosaccharide trehalose synthetase mutant of the present invention obtains higher thermal stability than the parent maltooligosaccharide trehalose synthetase by mutating an amino acid site of the maltooligosaccharide trehalose synthetase. The half-life of the mutant of the maltose oligosaccharide trehalose synthase of the invention is 41 hours longer than that of the wild type at 50 C, which is twice that of the wild type. That is to say, the stability of the mutant of the maltose oligosaccharide trehalose synthase of the invention is twice that of the wild type.
【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体
本专利技术涉及一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，属于酶工程以及蛋白质工程
技术介绍
海藻糖(Trehalose)是一种自然界中广泛存在的二糖，由两个葡萄糖通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，因为其独特的高保湿性，热酸稳定性和安全性，被广泛应用于食品，农业，医药，化妆品。从20世纪80年代开始，各国相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。我国卫生部于2005年正式批准海藻糖为新资源食品。目前，生产海藻糖的方法主要有三种，分别是酸化酶法、海藻糖合酶单酶法、MTSase和MTHase双酶法。其中，MTSase和MTHase双酶法采用液化后的淀粉作为底物，两个酶协同反应，生产海藻糖，该方法生产海藻糖的转化率较高，副产物较少，并用廉价的淀粉作为底物，降低了成本，因而得到了广泛的应用。在应用MTSase和MTHase双酶法制备海藻糖的过程中，淀粉经过高温液化后加入支链淀粉酶作用生成麦芽糊精；麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α,α-1,4-糖苷，产生α,α-1,1-糖苷键的分子内转糖苷作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖；麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。因此，麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)是双酶法生产海藻糖的关键。麦芽寡糖基海藻糖合成酶有两种类型，高温酶和中温酶，其中，高温酶在宿主中表达差，比活相对中温酶低，但中温酶因为稳定性较差，转化温度不能过高，导致反应中容易染菌，同时，还要在后续补加酶，成本较高，因而，对于中温酶的热稳定改造显得尤为重要。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，其通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的一个氨基酸位点进行突变，得到了与亲本麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比更高的热稳定性。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQIDNO.1麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第415位氨基酸进行突变得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述酶突变体是通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第415位氨基酸由甘氨酸突变为脯氨酸得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的来源为分支节杆菌(Arthrobacterramosus)。在本专利技术的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO.2。本专利技术提供了上述一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备方法，包含如下步骤：步骤1：根据突变位点设计突变引物，以携带麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的载体为模板进行定点突变，构建含编码突变体的基因的质粒载体；步骤2：将突变体质粒转化进宿主细胞；步骤3：挑选阳性克隆进行发酵培养，离心得到菌体并破壁即为麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的粗酶液。本专利技术提供了编码上述一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因的序列为SEQIDNO.3。本专利技术提供了携带上述基因的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒载体为pUC质粒、pET质粒或pGEX质粒。本专利技术提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。本专利技术提供了上述一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在生产海藻糖方面的应用。有益效果：(1)本专利技术构建了一个有意义的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，实现了麦芽寡糖基海藻糖合成酶热稳定性的提高；(2)本专利技术的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体在50℃的半衰期比野生型增加41h，是野生型的2倍，说明本专利技术的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的稳定性较野生型提高了2倍；(3)利用本专利技术的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体生产海藻糖，最适加酶量为2.0U/ml，而野生型的最适加酶量为2.5U/ml，二者转化率分别是63.6％，64.0％，说明本专利技术的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体在稳定性改善的同时，加酶量有所降低，且几乎不影响转化率；附图说明图1为野生型、本专利技术突变体G415P以及突变体G415D在50℃的热稳定性；图2为野生型和本专利技术突变体G415P产海藻糖的转化率。具体实施方式本专利技术的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下述实施例中涉及的检测方法如下：酶稳定性检测方法：将纯化的酶用20mMpH6.0磷酸盐缓冲液稀释至蛋白含量为0.25mg/mL，且pH为6.0，置于50℃恒温水浴中，每隔6h取样一次，测其残留酶活，比较其稳定性。残留酶活检测方法：预热：取1.9mL的0.2％麦芽糊精溶液(DE9～13pH6.0磷酸盐缓冲液)于具塞试管中，置于50℃水浴锅中预热10min。反应：加入0.1mL稀释后的发酵胞内粗酶液，振荡均匀，准确计时10min，加入3mLDNS，振荡均匀，终止反应；煮沸7min，冷却。测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至15mL，混匀；在540nm波长下测定吸光值并计算酶活力。(酶活定义：单位酶活相当于每分钟转化一微摩尔葡萄糖变为非还原性糖所需要的酶量。)海藻糖转化率检测方法：将反应产物稀释沉淀后用高效液相色谱(HPLC)测定其中海藻糖含量，计算转化率。计算公式＝海藻糖质量/大米淀粉质量*100/％HPLC检测条件：流动相(乙腈：水＝80：20)；流速：0.8mL/min，柱温40℃，NH2柱(APS-2HYPERSIL，ThermoScientific)，示差折光检测器(RID)。实施例1：野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶的表达以Arthrobacterramosus基因组为模板，以核苷酸序列为SEQIDNO.4：CATATGCCAGCTTCTACATAT的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNO.5：ATTACTGGTTGAAACCtAAAAGCTT的反向引物克隆含编码序列的目的基因treY，经过HindIII和NdeI双酶切后与表达载体pET24a连接，转入大肠BL21(DE3)，得到treY/pET24a/BL21(DE3)，接种treY/pET24a/BL21(DE3)于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)生长10h，按5％接种量将种子接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素)，将大肠杆菌工程菌在37℃培养2h后，加入0.01mmol/L终浓度的IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)进行诱导，并在25℃摇床继续培养发酵24h；将一定体积的发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，菌体沉淀用20mmol/L的pH6.0的磷酸盐缓冲液重新悬浮，混匀；用超声波细胞粉碎机破碎菌体悬浮液的细胞壁(超声细胞破碎机的工作条件：ψ6工作探头，工作时间10min，工作2s停3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第415位氨基酸进行突变得到的。
【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQIDNO.1麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第415位氨基酸进行突变得到的。2.如权利要求1所述的一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述酶突变体是通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第415位氨基酸由甘氨酸突变为脯氨酸得到的。3.如权利要求1或2所述的一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的来源为分支节杆菌(Arthrobacterramosus)。4.如权利要求1-3任一所述的一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，宿玲恰，陈春，封金云，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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