本发明专利技术公开了一种白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子及其dsRNA在害虫防治中的应用，基于GenBank数据库中登录号为KY350143的白背飞虱几丁质合成酶1a的核苷酸序列，获得SfCHS1a基因可变性剪切子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。基于序列SEQ ID NO：3合成该基因的dsRNA，为未来白背飞虱RNA干扰介导的害虫防治策略提供了候选基因，同时为研发新型杀虫剂提供了理论依据。属于昆虫基因工程技术领域。
Variable splicer of chitin synthase 1a (SfCHS1a) gene and its dsRNA application in pest control of white-backed planthopper
The invention discloses a chitin synthase 1a (SfCHS1a) gene variable splicer and its application in pest control. Based on the nucleotide sequence of the chitin synthase 1A registered in GenBank database as KY350143, the SfCHS1a gene variable splicer, such as SEQ ID, is obtained. NO:3 shows. The synthesis of dsRNA based on SEQ ID NO:3 provides a candidate gene for future pest control strategies mediated by RNA interference of white-backed planthopper, and provides a theoretical basis for the development of new pesticides. It belongs to the field of insect genetic engineering.
【技术实现步骤摘要】
白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子及其dsRNA在害虫防治中的应用
本专利技术涉及昆虫基因工程
，尤其是一种白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子及其dsRNA在害虫防治中的应用。
技术介绍
白背飞虱Sogatallafurcifera(Horváth)隶属于半翅目Hemiptera飞虱科Delphacidae，是亚太地区水稻生产上的一种重要害虫。其主要通过成虫、若虫直接刺吸稻株汁液，造成水稻生长缓慢，分蘖延迟，瘪粒增加，受害严重时可引起稻株枯死；此外，白背飞虱还是南方水稻黑条矮缩病病毒(southernriceblack-streakeddwarfvirus,SRBSDV)的主要传播媒介，造成的危害更是毁灭性的。当下白背飞虱的防控仍然主要依赖于化学杀虫剂，而化学杀虫剂的大量不合理使用，对生态环境和人类的健康构成了严重的威胁，同时也使得白背飞虱对多种杀虫剂产生了不同程度的抗性，因此，亟待发展一种新型的环境友好型的防治白背飞虱的策略。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是通过体外合成一段与靶基因同源的双链RNA(double-strandRNA,dsRNA)，导入昆虫体内，使内源性靶基因中同源mRNA降解，从而达到阻断基因翻译的目的。RNAi是昆虫基因功能研究的有效手段，它的成功应用为发展环境友好型、经济效果好的新型害虫防治策略提供了新思路和新方法。几丁质是昆虫表皮和中肠围食膜的主要组成部分。昆虫的表皮也由于几丁质和鞣化蛋白的存在而呈刚性结构，这无疑限制了昆虫的生长。在生长发育过程中，昆虫必须经历周期性地蜕去旧表皮和形成新表皮，这一过程依赖于昆虫体内几丁质生物合成和降解的精确控制。几丁质合成酶(chitinsynthase,CHS)是昆虫几丁质合成过程中最后一步生化反应的关键酶，调节昆虫的行为、变态发育及繁殖等。通过扰乱或阻断昆虫几丁质合成酶的形成，使得昆虫体内出现了蜕皮障碍、存活率降低、繁殖力下降等现象。由于人类与其它高等动物体内不存在几丁质，所以几丁质合成过程中的关键酶作为害虫防治的靶标相对安全，但是目前针对白背飞虱几丁质合成酶1a的研究未见相关报道，也未见针对白背飞虱几丁质合成酶1a基因的dsRNA的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子及其dsRNA在害虫防治中的应用，以实现环境友好型的防治白背飞虱。为实现上述目的，本专利技术采用如下方案：一种白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。其获取方法如下：基于GenBank数据库中登录号为KY350143的几丁质合成酶1a的核苷酸序列，利用PrimerPremier6.0软件设计特异性的上游引物1SEQIDNO：1和下游引物1SEQIDNO：2，通过PCR扩增获得。本专利技术还提供了一种dsRNA，该dsRNA由白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子合成。其合成方法如下：将核苷酸序列SEQIDNO：3的基因片段的PCR产物胶回收与纯化后，以该胶回收的产物为模板按照RNAiKit(Thermo)试剂盒说明书体外转录合成dsRNA。与现有技术相比，本专利技术的优点如下：利用本专利技术所述基因片段合成的dsRNA能够有效预防白背飞虱，通过体外合成一段与靶基因同源的双链RNA(double-strandRNA,dsRNA)，导入昆虫体内，使内源性靶基因中同源mRNA降解，从而达到阻断基因翻译的目的，为发展环境友好型、经济效果好的新型害虫防治策略提供了新思路和新方法；其使用时，通过显微注射法将dsRNA传递到白背飞虱体内，检测dsRNA对SfCHS1a基因的mRNA表达，并观察dsRNA对白背飞虱生长发育的影响。结果表明：注射dsRNA可以特异性地沉默白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因的mRNA表达，同时虫体有明显的蜕皮困难的畸形表型，并最终导致死亡，干扰5天后死亡率达到90％。本专利技术为未来白背飞虱RNA干扰介导的害虫防治策略提供了候选基因，同时本专利技术为研发新型杀虫剂提供了理论依据。附图说明图1为5龄白背飞虱若虫注射SfCHS1a基因的dsRNA后的SfCHS1a基因相对表达量。18SRNA为内参基因，dsGFP为对照组，dsCHS1a为实验组。图2为5龄白背飞虱若虫注射SfCHS1a基因的dsRNA后的累积存活率。其中dsGFP为对照组，dsCHS1a为实验组。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步说明，具体如下：实施例：白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子及其dsRNA1.白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子的获得1)基于GenBank数据库中登录号为KY350143的白背飞虱几丁质合成酶1a的核苷酸序列，利用PrimerPremier6.0软件设计特异性的上游引物1SEQIDNO：1和下游引物1SEQIDNO：2，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。2)选取白背飞虱5龄若虫15头，置于1.5mL无RNA酶的离心管中，经液氮冷冻后快速研磨成细粉，用TRIzol法进行总RNA的提取，具体操作步骤参照TRIzol试剂盒说明书进行。然后按照Sangon公司AMVFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒的说明书合成第一链cDNA。3)以上述合成的cDNA为模板，利用上游引物SEQIDNO：1和下游引物SEQIDNO：2进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25μL，包括：上下游引物(10μM)各1μL，10×LAPCRBuffer(Mg2+plus)2.5μL，dNTPMixture(2.5mM)4μL，cDNA2μL，Taq酶0.25μL和重蒸水14.25μL。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。4)PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，于凝胶成像仪检测目的条带长度并初步判断是否为预期的目的条带。随后对目的条带切胶，通过QuickGelExtractionKit试剂盒进行PCR产物回收与纯化，具体操作步骤参见试剂盒说明书。将胶回收产物连接至pMD18-T载体上(体系为回收产物2μL、SolationⅠ2.5μL和pMD18-T载体0.5μL，16℃孵育过夜)，随后连接体系转化至DH5(感受态细胞，经蓝白斑筛选和PCR检验后，将检验正确的克隆用LB液体培养基(含氨苄青霉素)培养过夜后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。2.白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子的dsRNA的合成1)基于所获得的SfCHS1a基因可变性剪切子序列SEQIDNO：3，利用PrimerPremier6.0软件设计带有T7启动子的上游引物2SEQIDNO：4和下游引物2SEQIDNO：5，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。2)以上述合成的cDNA作为模板，利用合成的dsRNA引物进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25μL，包括本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
【技术特征摘要】
1.一种白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。2.如权利要求1所述一种白背飞虱几丁质合成酶1a(SfCHS1a)基因可变性剪切子，其获取方法如下：基于GenBank数据库中登录号为KY350143的几丁质合成酶1a的核苷酸序列，设计特异性的上游引物1SEQIDNO：1和下游引物1SEQIDNO：2，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王召，杨洪，朱环，金道超，周操，龙贵云，
申请(专利权)人：凯里学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52
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