椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基和椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法技术

本发明专利技术提供了椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基和椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，属于椰子组培技术领域。椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4‑D 20～100mg、TDZ 0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g。本发明专利技术选用椰子幼嫩花序作为外植体，采用体细胞胚发生途径培养获得椰子再生植株，培养的后代具有与母树完全一致的遗传信息，具有繁殖数量多，稳定性高特点，解决了椰子种子苗后代性状分离，遗传性状不稳定的问题，将为开展优良椰子种苗快速繁殖提供育技术，也可为高效的基因转化提供再生途径。

【技术实现步骤摘要】
椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基和椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法
本专利技术属于椰子组培
，具体涉及椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基和椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法。
技术介绍
椰子(CocosnuciferaL.)是棕榈科椰子属多年生乔木，是典型的热带木本油料作物和食品作物，是世界热带地区重要的经济作物。目前我国椰子的产量只能满足总需求量的10％左右，供需矛盾突出，因此急需要加快椰子种植产业的发展。椰子多为异花授粉植物，生长周期长，繁殖系数低，杂种后代性状分离严重，个体间差异较大，很难获得同一性状的后代群体，同时椰子只有一个独立的茎干而不产生分枝，因而常规的营养繁殖手段如扦插、嫁接、高空压条等无法用于椰子的无性繁殖，因此有必要通过建立完整、高效、实用的椰子组培快繁技术体系，实现椰子优良无性品系培育，为推广优质椰子组织培养苗大规模繁育提供技术参考，也可为高效的基因转化提供再生途径。然而目前，对于椰子组织培养技术而言，尚无成功的体细胞胚发生和植株再生技术的案例，只能借鉴其他物种的体细胞胚发生技术和植株再生技术进行摸索和研究，但是不同物种遗传背景和生活环境差异巨大，对椰子的组织培养技术的研发帮助甚微。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供椰子体细胞胚性愈伤组织诱导培养基，具有对椰子胚性愈伤组织诱导率高的特点。本专利技术的目的还在于提供一种椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，使椰子植株再生实现了创造性突破。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4-D20～100mg、TDZ0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g。优选的，每升基本培养基中还含有2,4-D40～80mg、TDZ1～8mg、蔗糖23～28g和植物凝胶1.2～2.5g。本专利技术提供了一种椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，包括以下步骤：1)以椰子幼嫩花序作为外植体，进行消毒，将消毒后的外植体接种至所述的胚性愈伤组织诱导培养基上依次诱导培养和继代增殖培养，获得胚性细胞；所述诱导培养和继代增殖培养的温度独立为24～28℃；所述诱导培养和继代增殖培养独立为全暗培养；2)将所述步骤1)中的胚性细胞转接到体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚发生，获得体细胞胚；所述体细胞胚胎诱导培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有2,4-D5～50mg、TDZ0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g；所述诱导体细胞胚发生的条件如下：所述培养为光暗交替培养，光照强度900～1200lx，光照时间9～11h/d，培养温度25～28℃；3)将所述步骤2)中的体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基中成熟培养，获得成熟的鱼雷胚；所述体细胞胚成熟培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有2,4-D0～10mg、NAA0.1～1mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g；所述成熟培养的条件如下：培养温度为25-28℃；所述培养为光暗交替培养；光照的时间为10～12h/d，光照的强度为2000～2500lx；4)挑取所述步骤2)中的鱼雷胚转入体细胞胚萌发培养基中萌发培养，获得萌发的体细胞胚；所述体细胞胚萌发培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基含有GA30.1～5mg、6-BA0.1～1mg、蔗糖20～50g和植物凝胶1～3g；所述萌发培养条件为：培养温度为25～28℃；萌发培养为光暗交替培养，；所述光照培养的时间为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx；5)所述将萌发的体细胞胚转移到植株再生培养基上培养，获得完整的再生植株；所述植株再生培养基为1/2MS培养基为基本培养基，每升基本培养基含有IBA0～10mg、NAA0.1～1mg、蔗糖20～50g和植物凝胶1～3g；所述培养条件为：培养温度为25～28℃；培养为光照培养；所述光照培养的时间为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx。优选的，所述步骤2)中体细胞胚胎诱导培养基为每升基本培养基含有2,4-D10mg、TDZ2～7mg、蔗糖23～27g和植物凝胶1.5～2.5g。优选的，所述步骤2)中诱导体细胞胚发生的条件如下：光照强度1000lx，光照时间9～11h/d，培养温度25～28℃。优选的，所述步骤3)中所述体细胞胚成熟培养基为每升基本培养基含有2,4-D2～7mg、NAA0.3～0.7mg、蔗糖22～27g和植物凝胶1.5～2.5g。优选的，所述步骤3)中成熟培养的条件如下：培养温度为26℃；所述培养为光暗交替培养；光照的时间为11h/d，光照的强度为2200～2400lx。优选的，所述步骤4)中体细胞胚萌发培养基为每升基本培养基含有GA30.5～4mg、6-BA0.2～0.7mg、蔗糖30～40g和植物凝胶1.6～2.4g。优选的，所述步骤4)中萌发培养条件为：培养温度为26℃；所述光照培养的时间为11h/d，光照强度为2200～2400lx。优选的，所述步骤1)中消毒的方法包括以下步骤：将用1号消毒液擦拭椰子幼嫩花序的外层2～3次，然后剥掉外层佛焰苞，将露出的椰子幼嫩花序用2号消毒液浸泡25～35s，冲洗后用3号消毒液浸泡5～6min，冲洗2～3次，再用4号消毒液进行浸泡6～8min，冲洗3～5次，获得消毒后的外植体；所述1号消毒液为体积分数50％的酒精水溶液；所述2号消毒液为体积分数75％酒精水溶液；所述3号消毒液为质量分数0.1％HgCl2溶液；所述4号消毒液为体积分数6～12％次氯酸钠溶液。本专利技术提供了一种椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4-D20～100mg、TDZ0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g。本专利技术所述诱导培养基是以Y3培养基为基本培养基，但常规的培养基一般选用MS培养基，对椰子体胚发生与再生作用不明显，无法进行脱分化形成胚性愈伤组织；本专利技术提供的诱导培养基相对于常规使用的MS培养基具有显著诱导率高的特点，同时每升基本培养基中还含有20～100mg的2,4-D，与现有技术相比，本专利技术中诱导培养基的2,4-D浓度比常规其他作物的胚性愈伤组织培养基的激素浓度(比如2,4-D)至少高1个数量级，本专利技术提供的2,4-D浓度相对于其他作物中基本达到致死剂量，但是作用于椰子体细胞时不仅保证了成功诱导，而且还能得到较高的诱导率。最后本专利技术所述诱导培养基将0～10mg/L的TDZ(噻苯隆)与20～100mg/L的2,4-D配比使用，达到更高的诱导率，这与常规的培养方法有很大不同。实验表明，采用本专利技术提供的诱导培养基进行实验，胚性愈伤组织诱导率达到41％以上。本专利技术提供了一种椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，选用椰子幼嫩花序作为外植体，采用体细胞胚发生途径培养获得椰子再生植株，培养的后代具有与母树完全一致的遗传信息，具有繁殖数量多，稳定性高特点，解决了椰子种子苗后代性状分离，遗传性状不稳定的问题，将为开展优良椰子种苗快速繁殖提供育技术，也可为高效的基因转化提供再生途径。胚性愈伤组织诱导率为41％，出胚率为21％，出苗率约为11％，3个月增殖倍数为2.1，按此计算，100本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4‑D 20～100mg、TDZ 0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g。

【技术特征摘要】
1.一种椰子体细胞胚性愈伤组织的诱导培养基，其特征在于，以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基中还含有2,4-D20～100mg、TDZ0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g。2.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，每升基本培养基中还含有2,4-D40～80mg、TDZ1～8mg、蔗糖23～28g和植物凝胶1.2～2.5g。3.一种椰子体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以椰子幼嫩花序作为外植体，将所述外植体消毒后接种至权利要求1或2所述的诱导培养基上依次进行诱导培养和继代增殖培养，获得胚性细胞；所述诱导培养和继代增殖培养的温度独立为24～28℃；所述诱导培养和继代增殖培养独立为全暗培养；2)将所述步骤1)中的胚性细胞转接到体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚发生，获得体细胞胚；所述体细胞胚胎诱导培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基还含有2,4-D5～50mg、TDZ0～10mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g；所述诱导体细胞胚发生的条件如下：所述培养为光暗交替培养，光照强度900～1200lx，光照时间9～11h/d，培养温度25～28℃；3)将所述步骤2)中的体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基中成熟培养，获得成熟的鱼雷胚；所述体细胞胚成熟培养基以Y3培养基为基本培养基，每升基本培养基还含有2,4-D0～10mg、NAA0.1～1mg、蔗糖20～30g和植物凝胶1～3g；所述成熟培养的条件如下：培养温度为25～28℃；所述培养为光暗交替培养；光照的时间为10～12h/d，光照的强度为2000～2500lx；4)挑取所述步骤2)中的鱼雷胚转入体细胞胚萌发培养基中萌发培养，获得萌发的体细胞胚；所述体细胞胚萌发培养基以Y3培养基为基本培养基，基本培养基还含有GA30.1～5mg、6-BA0.1～1mg/L、蔗糖20～50g和植物凝胶1～3g；所述萌发培养条件为：培养温度为25～28℃；培养为光暗交替培养；所述光照培养的时间为10～12h/d，光照强度为2000～2500lx；5)将所述步骤4)中萌发的体细胞胚转移到植株再生培养基上进行植株再生培养，获得完...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹积鑫，林位夫，张希才，曹建华，潘登浪，陈俊明，李家宁，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46