一种银杏脱毒组织培养方法技术

本发明专利技术公开了一种银杏脱毒组织培养方法，包括如下步骤：（1）选材：整枝选取1~2年生芽饱满、无腐无病害、健壮银杏枝条；（2）催芽：将选取好的银杏枝条进行催芽；（3）表面处理；（4）消毒；（5）切割；（6）初代培养；（7）增殖继代：将无菌苗将其接种到相应培养基上进行增殖继代培养；（8）生根培养；（9）驯化炼苗。本发明专利技术的有益效果是：银杏通过组织培养，可以起到脱毒、快繁、种质资源保存、品质改良的作用，大幅度提高了银杏质量和品质；确定了组织培养中控制分化、继代生长、生根等的培养基成分，研究确定了生长调节物质的种类、浓度以及培养条件的最佳优化选择，攻克了银杏组织培养过程中的技术壁垒，达到很好的培养效果。

【技术实现步骤摘要】
一种银杏脱毒组织培养方法
本专利技术属于植物组织培养
，具体的说涉及一种银杏脱毒组织培养方法。
技术介绍
银杏又名白果、公孙树、鸭脚子、鸭掌树，是新生代第四纪冰川期的孑遗植物，为我国独存的珍稀名贵树种，也是目前世界上珍稀裸子植物之一，现仅存一科一属一种，素有裸子植物“活化石”之称，在植物学上具有重要的科学价值。我国是银杏的故乡，大面积种植区有山东、江苏、安徽南部、浙江、江西北部、河南、湖南、湖北、广西、四川。银杏兼有材用、果用、药用、观赏于一体的特点，其材质优良、不翘不裂、宜加工，为雕刻、建筑、家具、装演等高级用材。种核富含营养，是著名的高档营养保健食品、药品，为我国大宗出口树生果仁干果之一。银杏叶内主要含有黄酮类和银杏内酯类等药用成分，黄酮类化合物具有抗衰老、提高免疫机能、防治心血管疾病的作用，银杏内酯是银杏特有的带有特丁基的二菇内酯类化合物，是治疗气管炎、哮喘、内毒素休克、器官免疫排斥反应等多种炎症疾病的新型治疗剂，被国际医药部门列为新一代重要药用资源。银杏寿命长达多年，树姿挺拔、秀丽，叶形似鸭脚,现己广泛应用于园林和盆景业中。综上，银杏在诸多领域的开发利用，对银杏的繁殖和育种提出了新的要求。银杏是雌雄异株植物，实生苗定植后一般需要才能开花结果，分出雌雄，银杏常规育种时间长，效率低。开展银杏组织培养和遗传转化，进行银杏分子育种有重要的理论和现实意义。银杏组织培养的研究始于世纪年代，主要以银杏配子体、原生质体、胚成熟与未成熟和营养器官为材料，对胚胎学、形态发生及培养条件等进行了研究探索。陕西农业大学，温银元在其硕士学位论文中，以银杏优良品种“佛手”为材料，在离体条件下研究不同种类、不同浓度的激素对胚离体培养、愈伤组织的诱导与分化以及腋芽的萌发与生长的影响；用赤霉素和乙烯利调控试管苗的性别分化,通过同工酶和含量对银杏的雌雄进行早期鉴别,满足市场对雌性或雄性植株的需求，为银杏的定向育种提供理论依据和实践指导。文中将重点放在雌雄性的定向育种上，在组织培养基的选择和培养条件的选择和优化方面有待提高。中国专利CN07047319A一种银杏的组织培养方法及生根培养基以琼脂、蔗糖、培养基母液、6-苄氨基嘌呤溶液和萘乙酸溶液，以及银杏树枝活性炭或银杏果壳活性炭为原料，制备生根培养基；以银杏侧芽带叶茎尖为外植体，将消毒处理后的外植体接种到生根培养基中，置于500~10000Lux光照、20~25℃环境下培养。本申请技术方案虽然直接诱导生根，缩短育苗周期；能够最大限度的保持亲本的优良性状在生根培养基中加入银杏树枝活性炭或银杏果壳活性炭，能够改善组织培养苗的褐化现象，同时还有抑菌和促进生长的作用，但是在组织培养过程中只采用一种培养基，不能满足银杏外植体初代和增殖培养的需求。用银杏进行组织培养研究也有一些报道，但是存在生产成本高，初代接种污染率高，试管苗玻璃化，分化能力自衰和成活率低等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述银杏组织培养的缺陷，对银杏的脱毒组织培养方法进行系统的研究，经过大量实验，得到一种操作简便、提高银杏产量与品质的培养方法。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种银杏脱毒组织培养方法，包括：(1)选材：整枝选取1~2年生芽饱满、无腐无病害、健壮银杏枝条；(2)催芽：将选取好的银杏枝条置于光照室内，维持温度28℃，光照强度5000Lux，光照时间24h，照射7d，选取银杏嫩芽为外植体；(3)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用0.5%吐温-80清洗10~15min，采用流水冲洗干净；(4)消毒：采用75%酒精消毒、0.1%HgCl溶液消毒1~5min，无菌水冲洗干净；(5)切割：将消毒好的银杏小段切口进行更新处理，去掉叶片，保留生长点；(6)初代培养：将处理好的银杏小段接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照14~18h、光照强度为5000~7000Lux、培养45~65d；(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照16~20h、光照强度为6000~8000Lux、培养25~35d；重复上述增殖过程；(8)生根：选取长势健壮的银杏苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照10~14h、光照强度为6000~10000Lux的环境中，培养20~35d；(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的银杏苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85~99%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，15d后将银杏苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；其中：培养基Ⅰ为B5培养基中添加0.1~0.5mg/LNAA、0.1~1.0mg/LKT、0.1~1.0mg/L活性炭、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；培养基Ⅱ为B5培养基中添加0.1~2.0mg/LKT、0.1~1.0mg/LTDZ、0.1~2.0mg/LIBA、0.1~1.0mg/L活性炭、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；培养基Ⅲ为B5培养基中添加0.1~1.0mg/LIBA、0.1~2.0mg/LGA3。作为优化的，一种银杏脱毒组织培养方法，包括：(1)选材：整枝选取1~2年生芽饱满、无腐无病害、健壮银杏枝条；(2)催芽：将选取好的银杏枝条置于光照室内，维持温度28℃，光照强度5000Lux，光照时间24h，照射7d，选取银杏嫩芽为外植体；(3)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用0.5%吐温-80清洗10~15min，采用流水冲洗干净；(4)消毒：采用75%酒精消毒、0.1%HgCl溶液消毒1~5min，无菌水冲洗干净；(5)切割：将消毒好的银杏小段切口进行更新处理，去掉叶片，保留生长点；(6)初代培养：将处理好的银杏小段接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照16h、光照强度为5000~7000Lux、培养50~60d；(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照18h、光照强度为7000Lux、培养30d；重复上述增殖过程；(8)生根：选取长势健壮的银杏苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照12h、光照强度为7000~9000Lux的环境中，培养25~30d；(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的银杏苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85~99%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，15d后将银杏苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；作为优化的，培养基Ⅰ为B5培养基中添加0.2mg/LNAA、0.5mg/LKT、0.5mg/L活性炭、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；作为优化的，培养基Ⅱ为B5培养基中添加1.0mg/LKT、0.5mg/LTDZ、1.0mg/LIBA、0.5mg/L活性炭、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；作为优化的，培养基Ⅲ为B5培养基中添加0.5mg/LIBA、1.0mg/LGA3。作为优化的，所述培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和培养基Ⅱ的pH均被调节至5.8。作为优化的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种银杏脱毒组织培养方法，包括：(1)选材：整枝选取1~2年生芽饱满、无腐无病害、健壮银杏枝条；(2)催芽：将选取好的银杏枝条置于光照室内，维持温度28℃，光照强度5000Lux，光照时间24h，照射7d，选取银杏嫩芽为外植体；(3)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用0.5%吐温‑80清洗10~15min，采用流水冲洗干净；(4)消毒：采用75%酒精消毒、0.1%HgCl溶液消毒1~5min，无菌水冲洗干净；(5)切割：将消毒好的银杏小段切口进行更新处理，去掉叶片，保留生长点；(6)初代培养：将处理好的银杏小段接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照14~18h、光照强度为5000~7000Lux、培养45~65d；(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照16~20h、光照强度为6000~8000Lux、培养25~35d；重复上述增殖过程；(8)生根：选取长势健壮的银杏苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照10~14h、光照强度为6000~10000Lux的环境中，培养20~35d；(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的银杏苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85~99%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，15d后将银杏苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；其中：培养基Ⅰ为B5培养基中添加0.1~0.5mg/LNAA、0.1~1.0mg/LKT、0. 1~1.0mg/L活性炭、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；培养基Ⅱ为B5培养基中添加0.1~2.0mg/LKT、0.1~1.0mg/LTDZ、0.1~2.0mg/LIBA、0. 1~1.0mg/L活性炭、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；培养基Ⅲ为B5培养基中添加0.1~1.0mg/LIBA、0.1~2.0mg/LGA3。...

【技术特征摘要】
1.一种银杏脱毒组织培养方法，包括：(1)选材：整枝选取1~2年生芽饱满、无腐无病害、健壮银杏枝条；(2)催芽：将选取好的银杏枝条置于光照室内，维持温度28℃，光照强度5000Lux，光照时间24h，照射7d，选取银杏嫩芽为外植体；(3)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用0.5%吐温-80清洗10~15min，采用流水冲洗干净；(4)消毒：采用75%酒精消毒、0.1%HgCl溶液消毒1~5min，无菌水冲洗干净；(5)切割：将消毒好的银杏小段切口进行更新处理，去掉叶片，保留生长点；(6)初代培养：将处理好的银杏小段接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照14~18h、光照强度为5000~7000Lux、培养45~65d；(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照16~20h、光照强度为6000~8000Lux、培养25~35d；重复上述增殖过程；(8)生根：选取长势健壮的银杏苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照10~14h、光照强度为6000~10000Lux的环境中，培养20~35d；(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的银杏苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85~99%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，15d后将银杏苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；其中：培养基Ⅰ为B5培养基中添加0.1~0.5mg/LNAA、0.1~1.0mg/LKT、0.1~1.0mg/L活性炭、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；培养基Ⅱ为B5培养基中添加0.1~2.0mg/LKT、0.1~1.0mg/LTDZ、0.1~2.0mg/LIBA、0.1~1.0mg/L活性炭、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；培养基Ⅲ为B5培养基中添加0.1~1.0mg/LIBA、0.1~2.0mg/LGA3。2.根据权利要求1所述的一种银杏脱毒组织培养方法，其特征在于：包括：（1）选材：整枝选取1~2年生芽饱满、无腐无病害、健壮银杏枝条；（2）催芽：将选取好的银杏枝条置于光照室内，维持温度28℃，光照强度5000Lux，光照时间24h，照射7d，选取银杏嫩芽为外植体；(3)表面处理：将收集好的外植体采用流水...

【专利技术属性】
技术研发人员：金红梅，李亚，
申请(专利权)人：山东组培农业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37