一种抗H7N9抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种抗H7N9抗体及其制备方法和应用，所述抗体的重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗原结合片段的轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术的抗体与H7N9‑HA的亲和力在nM级别，中和活性高于已知的广谱抗体FI6，制备方法标准可控、成本低廉、简单高效、适于标准化生产，为疫苗研制提供了新的思路。

Anti H7N9 antibody and preparation method and application thereof

The present invention provides an anti-H7N9 antibody and its preparation method and application. The nucleic acid sequence of the heavy chain variable region of the antibody is shown as SEQ ID NO.1, and the nucleic acid sequence of the light chain variable region of the antigen binding fragment is shown as SEQ ID NO.2. The affinity of the antibody and H7N9 HA is at nM level, and the neutralization activity of the antibody is higher than that of the known broad-spectrum antibody FI6. The preparation method is controllable, low cost, simple and efficient, and suitable for standardized production, which provides a new idea for vaccine development.

【技术实现步骤摘要】
一种抗H7N9抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药和免疫学
，涉及一种抗H7N9抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
流感是威胁人类健康的主要因素之一，H7N9、H5N6和H10N8等禽流感病毒引起的人感染禽流感，发病严重、死亡率高，给人类健康、经济发展和社会稳定带来严重的影响。治疗流感的措施主要包括疫苗和抗病毒药物，其中，疫苗是预防流感病毒感染最有效的方式之一，但对突发的新亚型流感病毒株缺乏保护作用；抗病毒药物在耐药病毒株产生之前具有治疗作用，感染后期治疗效果不明显。目前的抗病毒药物包括M2离子通道蛋白抑制剂和神经氨酸酶(NA)抑制剂，例如金刚烷胺和奥司他韦，这些药物虽然能够有效地抑制病毒复制，但容易造成耐药株的出现。流感康复者的血清中含有高滴度的抗体，能够有效救治流感临床重症者，然而上述抗体获取难度大，效价不均一，难以应对大范围的流感爆发。抗体的体外生产技术十分重要，目前常用的单克隆抗体筛选方法主要有噬菌体展示技术、酵母展示技术、B细胞永生化技术和单细胞PCR技术等。噬菌体展示技术最初由美国Smith博士在1985年提出，噬菌体编码的蛋白基因通过插入外源的DNA片段，使外源基因的表达蛋白与噬菌体的外壳蛋白相融合，展示在噬菌体的表面。该技术最常用的载体为溶原性的丝状噬菌体，例如M13、fI和fd，噬菌体的基因组为单链环状DNA，外部被外壳蛋白g8p包裹。噬菌体抗体库主要具有以下优势：不依赖于人或动物的免疫反应，适应于大规模工业化生产，能够快速筛选出108以上的噬菌体抗体库，可以获得不同亲和力的抗体。在噬菌体抗体库的构建过程中，抗体的重链与轻链基因会发生重组，这个过程模拟了机体中抗体亲和力的成熟过程。酵母展示技术由KDWittrup实验室建立，2001年转让给Abbott实验室，目前已广泛应用于蛋白质工程领域。这项技术是分离和改造抗体的有力手段，当抗体的重链可变区和轻链可变区由linker链接成单链可变区抗体(scFv单链抗体)后，与酵母表面细胞壁上的Aga2p蛋白融合，并与标记荧光素的抗原结合，该项技术通过FACS分选有结合活性的酵母细胞，进行抗体的体外细胞表达。B细胞永生化技术最初由EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)介导转化，以提高细胞的增殖能力和分泌抗体的活性，目前该项技术已经被广泛应用于单克隆抗体的制备和B细胞研究中。Corti等在研究T淋巴细胞、B淋巴细胞的应答过程中，运用了B淋巴细胞永生化技术和高通量细胞筛选技术，得到了具有较强增殖能力和抗体分泌活性的记忆B淋巴细胞。单细胞PCR技术是一种体外克隆和表达单个抗原特异性B细胞抗体基因的技术，该技术需要的细胞少、效率高、基因多样性好，通过重链和轻链的随机重组可以建立107-1012库容量的抗体序列，并筛选到亲和力强的抗体，适用于有丰富抗原特异性B细胞的人群，在新发突发传染病领域具有广阔的应用前景。然而，单细胞PCR技术仍然存在一些缺陷。例如在猕猴浆母细胞抗体的筛选过程中，由于中国猕猴与印度猕猴在表型和基因组上具有巨大差异，通过单细胞PCR实验得到的重链的扩增效率达65％以上，但轻链的扩增效率低于40％，总体的克隆效率不高；另外，由于中国猕猴基因组的测序质量不高，有大量gap存在，难以找出有效的V基因序列设计引物进行单细胞PCR扩增。目前有报道的扩增引物效果不理想，多套引物混合使用可以提高扩增效率，但扩增工作量大，难度大。因此，建立一种效率较高、操作简便的方法制备亲和力强的流感病毒抗体，在免疫学领域具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种抗H7N9抗体及其制备方法和应用，所述抗体无免疫原性、特异性好、亲和力高、成分清晰、无病原体污染等潜在风险，广泛适用于各种人群，所述制备方法简单高效、适于标准化生产。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种抗原结合片段，所述抗原结合片段的重链可变区的核酸序列如SEQIDNO.1所示；所述抗原结合片段的轻链可变区的核酸序列如SEQIDNO.2所示；所述SEQIDNO.1所示的核酸序列为：CAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAGGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGCTTCTGGATACACTTTTACCACTTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGGTGCCCGGAAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGGCGATTGATCCTAGTGACTCTGGAGCCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAACTCCATTAACACCACCTACCTACAGTGGAAAAGCCTGAGGTCCTCGGACACCGCCACCTATTACTGCGCAAAGTCTGGGGGGTGGTGGGACATCGACGTCTGGGGCCCTGGCACCCCAATCACCACCTCCTCAG；所述SEQIDNO.2所示的核酸序列为：GAAATTGTAATGACGCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGAGCCAGTCAGGGTATTAGCAACTGGTTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATCGCAACTTATTACTGTCAGCATGGTTATGGTACCCCATTCACTTTCGGCCCCGGGACCAAACTGGATATCAAA.本专利技术中，所述抗原结合片段效价高、特异性强、无异种血清反应、不存在交叉污染、成分清晰，既避免了异源血清蛋白引起的过敏反应，又避免了人源免疫球蛋白来源限制问题和潜在病原体污染的问题。第二方面，本专利技术提供了一种抗H7N9抗体，所述抗体包括如第一方面所述抗原结合片段。优选地，所述抗体还包括恒定区。本专利技术中，所述恒定区的重链的核酸序列如SEQIDNO.3所示，所述恒定区的轻链的核酸序列如SEQIDNO.4所示；所述SEQIDNO.3所示的核酸序列为：ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段的重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗原结合片段的轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段的重链可变区的核酸序列如SEQIDNO.1所示；所述抗原结合片段的轻链可变区的核酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种抗H7N9抗体，其特征在于，所述抗体包括如权利要求1所述抗原结合片段；优选地，所述抗体还包括恒定区。3.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包括编码如权利要求1所述抗原结合片段和/或如权利要求2所述抗体的核苷酸序列。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求3所述的DNA片段。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求3所述的DNA片段和/或如权利要求4所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞包括293T细胞。6.一种如权利要求2所述抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)采集免疫个体的B细胞，PCR获得抗体可变区的DNA片段；(2)将步骤(1)所述DNA片段连接入表达载体，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；(3)将筛选后的表达载体转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述抗体。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述免疫个体...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗佳，陈凌，牛学锋，李正锋，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44