本发明专利技术公开了一种miR‑15a‑5p在提高CAR‑T细胞抗肿瘤能力中的应用，属于生物医学技术领域。本发明专利技术通过将Anti‑CD19 CAR载体与miRNA‑15a‑5p抑制剂共转T细胞，发现miRNA‑15a‑5p抑制剂能够提高CAR‑T细胞内的CD28的表达，使T细胞在免疫过程中快速增值、活化，提高抗肿瘤能力。因此，miRNA‑15a‑5p可以作为靶标用于筛选提高CAR‑T细胞抗肿瘤能力的药物，miRNA‑15a‑5p的抑制剂可用于制备提高CAR‑T细胞抗肿瘤能力的药物。本发明专利技术可以极大地提高CAR‑T细胞的抗肿瘤能力，为抗肿瘤药物的开发提供了新的方向。
Application of miR-15a-5p in improving the anti-tumor ability of CAR-T cells
The invention discloses an application of microRNA 15A 5p in improving the anti-tumor ability of CAR T cells, which belongs to the field of biomedical technology. By co-transfecting the Anti CD19 CAR vector with the inhibitor of microRNA15a 5p into T cells, the invention finds that the inhibitor of microRNA15a 5p can increase the expression of CD28 in the cells of CAR 5p, so that the T cells can rapidly increase in value, activate and enhance the anti-tumor ability in the course of immunization. Therefore, microRNA 15A 5p can be used as a target for screening drugs to improve the anti-cancer ability of CAR T cells. The inhibitor of microRNA 15A 5p can be used to prepare drugs to improve the anti-cancer ability of CAR T cells. The invention can greatly improve the anti-tumor ability of CAR T cells, and provides a new direction for the development of anti-cancer drugs.
【技术实现步骤摘要】
miR-15a-5p在提高CAR-T细胞抗肿瘤能力中的应用
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种miR-15a-5p在提高CAR-T细胞抗肿瘤能力中的应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptorT-Cell,CAR-T)是近年来新兴的免疫治疗技术，通过将靶细胞的特异性受体组装到T细胞上再输入病人体内，起到特异性肿瘤杀伤效果，取得不错的疗效。目前应用于临床的主要是第三代CAR-T，即在T细胞表面组装抗原受体的同时串联一些体细胞激活所需的共刺激分子，通常包括CD28和4-1BB，使嵌合在T细胞表明的抗原受体与靶抗原结合的同时激活共刺激分子使T细胞完全活。CD28为T细胞表面B7类分子的受体，可以在T细胞增殖和分化中起到共刺激的作用，为T细胞完全活化提供条件，还与细胞周期、表过遗传修饰、代谢和翻译后修饰等有关。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种miR-15a-5p在提高CAR-T细胞抗肿瘤能力中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术通过将Anti-CD19CAR载体与miRNA-15a-5p抑制剂antagomir(产品编号：miR30000068-1-10，广州市锐博生物科技有限公司)共转T细胞，发现miRNA-15a-5p抑制剂能够显著地提高T细胞内CD28的mRNA水平和蛋白质水平，以及细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平，显著增强T细胞的细胞活性和杀瘤效果。这些结果表明miRNA-15a-5p抑制剂能够提高CAR-T细胞内的CD28的表达，使T细胞在免疫过程中快速增殖、活化，提高抗肿瘤能力。因此，miRNA-15a-5p可以作为靶标用于筛选提高CAR-T细胞抗肿瘤能力的药物。miRNA-15a-5p的抑制剂可用于制备提高CAR-T细胞抗肿瘤能力的药物。一种提高CAR-T细胞抗肿瘤能力的药物，包含miRNA-15a-5p的抑制剂。所述的药物还可以包含辅料，如赋形剂、载体等。所述的miRNA-15a-5p的抑制剂包括针对miRNA-15a-5p的antagomir或siRNA，以及其他能够抑制miRNA-15a-5p活性的化学物质。本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术可以极大地提高CAR-T细胞的抗肿瘤能力，为抗肿瘤药物的开发提供了新的方向。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1一、Anti-CD19CAR载体的构建CAR的元件组成包括：引导链(leader)、抗CD19单链抗体(CD19-scFv)、铰链区(hinge)、CD28跨膜区(CD28TM)、CD28膜内区(CD28ICD)、4-1BB和CD3ζ链。各元件序列均为现有已知技术(Pub.NO.:US2014/0271635A1)。各元件通过重叠延伸PCR(OE-PCR)多步依次串联在一起。通过将leader和CD19-scFv、hinge和CD28TM、CD28ICD和4-1BB两两相连成三段，再与CD3ζ两两相连，最终将上述序列依次串联在一起。所使用的DNA扩增酶为pfuDNA扩增酶(北京擎科新业生物技术有限公司)。PCR反应体系及反应条件如下：反应体系：pfu2×Mix10μL，模板1μL，引物2μL，超纯水7μL。反应条件：95度5分钟；95度30秒，55度30秒，72度1分钟，30个循环；72度5分钟，4度∝。通过EcoR1和Mlu1两个酶切位点将CAR基因片段连入基于HIV-1型改造的慢病毒表达载体pLVX-EF1α-IRES-Puro(产品编号：VT2015，优宝生物)，构建好的CAR载体质粒命名为pLVX-EF1α-CD19，转化入大肠杆菌DH5α克隆载体质粒。二、慢病毒anti-CD19CAR的包装(1)在转染的前一天，传代准备细胞：用0.25％胰蛋白酶消化293T细胞，以含10％血清的DMEM培养基(美国Gibco公司)调整细胞密度后，按照每10cm细胞培养皿接种6～8×106细胞数到10cm细胞培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱培养，16h～24h后待细胞密度生长到80％～90％时即可用于转染。(2)第二天，在转染前2～4h，用5mL不含双抗的完全培养基换液(DMEM+10％FBS)。(3)应用PEI进行转染A、取DMEM低糖无血清无双抗培养基(美国Gibco公司)两份各500μL分别加入两个1.5mLEP管中，标记为A、B。B、在A中加入载体上述构建好的CAR慢病毒表达载体pLVX-EF1α-CD196μg和psPAX23μg、pMD2.G1μg慢病毒包装载体，充分混匀。C、在B中加入25μL(1μg/μL)PEI试剂(北京海德创业生物科技有限公司)，充分混匀。D、将B中试剂加入A中，漩涡震荡混匀，37℃孵育20分钟。E、然后将混合物逐滴均匀加入到10cm细胞培养皿中，轻微混匀。置于37℃、5％CO2培养箱中培养。(4)第三天，即培养12h～16h后弃去培养基，用10mL新鲜的完全培养基(DMEM+10％FBS+P/S)换液。(5)第四天，即换液后24h，收集上清液，置于4℃冰箱保存，然后加入10mL新鲜的完全培养基(DMEM+10％FBS+P/S)至10cm细胞培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱继续培养。(6)第五天：再一次收集上清，与第一次收集的上清液混合，1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以0.45μmPVDF滤器(millipore公司)过滤至50mL圆底离心管中。(7)4℃、50000g高速离心2h，离心后可用记号笔对病毒沉淀做好标记。(8)小心弃去上清，晾干，按200μL/10cm培养皿的量加入DMEM(美国Gibco公司)(不含血清、双抗)或者PBS重悬病毒沉淀，室温静置2h，然后用移液器轻轻地吹匀(避免产生气泡)，继续室温放置30min，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5mLEP管中，-80℃冰箱保存。三、单核细胞(PBMCs)的获取抗凝处理的正常人体捐赠的外周血、PBS(美国Gibco公司)、淋巴细胞分离液Ficoll(北京Solarbio公司)各3mL。先在15mL离心管中加入3mL淋巴细胞分离液Ficoll，3mL外周血与3mLPBS相互混匀后顺管壁轻轻加入到Ficoll上层，水平离心400g×30分钟。离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，为单个核细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。四、CD3+T细胞的分离(1)免疫磁珠的洗涤将小管内的Anti-CD3免疫磁珠(CD3MicroBeads,human，德国美天旎公司)摇匀悬浮，取出所需量的免疫磁珠(正常人体每毫升外周血大概含有106个PBMC，免疫磁珠:PBMC约为3:1)到1.5mL试管内，加入1mLT细胞完全培养基(美国Gibco公司)(1640，10％FBS，1％penicillin-streptomycin，50μMβ-mercaptoethanol，100U/mLIL-2)并混悬好，漩涡洗涤1min。将试管放入磁体架内静置吸附1分本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.miRNA‑15a‑5p作为靶标在筛选提高CAR‑T细胞抗肿瘤能力的药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.miRNA-15a-5p作为靶标在筛选提高CAR-T细胞抗肿瘤能力的药物中的应用。2.miRNA-15a-5p的抑制剂在制备提高CAR-T细胞抗肿瘤能力的药物中的应用。3.一种提高CAR-T细胞抗肿瘤能力的药物，其特征在于：包含miRNA...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖兴华，张子健，项园，戴周彤，黄凤，张慧敏，李含含，李佳蓬，李慧，杜庆，张同存，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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