一种HoxD10基因在胃癌中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种HoxD10基因在胃癌中的应用，本发明专利技术通过实验发现胃癌细胞中HoxD10的表达水平影响细胞的增值、迁移能力、凋亡等，对胃癌的发生起重要作用，且转录因子HoxD10在胃癌中甲基化的表达调控和启动子甲基化检测可应用于胃癌的诊断，此外，本实验通过软件预测、构建载体，在胃癌细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了IGFBP3是HoxD10的靶基因，并进一步确定了其活性结合位点，这为利用HoxD10为胃癌提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。本发明专利技术可为胃癌的诊断和预后提供有力的技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种HoxD10基因在胃癌中的应用
本专利技术属于生物工程
，涉及一种HoxD10基因在癌症中的应用，尤其涉及其在胃癌中的应用。
技术介绍
胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一，其死亡率占居我国肿瘤死因的第二位。近半数胃癌患者一经诊断就处于淋巴结或远处转移，远处转移患者的五年生存率不到5％。胃癌进展涉及多因素、多步骤的生物学过程，与癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关，对抑癌基因的深入研究能更好的揭示胃癌发生发展的机制。表观遗传学研究发现在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，抑癌基因表达发生了可遗传的信息变化，导致基因失活，抑癌功能丧失。其中，DNA甲基化是最重要的基因表观修饰方式之一，也是抑癌基因失活的最重要机制之一。HoxD10属于人类同源盒基因(Homeobox,Hox)家族一员，Hox基因分为A、B、C和D4簇至少39个成员。Hox编码的同源蛋白是重要的转录因子，Hox蛋白同源结构域的氨基酸残臂有几个核心的共同结合元件，包括TTAT、TAAT和TTAC，结合后可以调节下游基因的转录翻译，进而调控胚胎细胞的增殖和分化，也是决定细胞表型的调节因素。近年来还发现Hox基因的表达影响多种实体肿瘤的侵袭、转移等生物学行为。通过基因甲基化岛的筛选研究，发现HoxD10是受启动子甲基化调控的重要候选胃癌抑制基因。阐明HoxD10在胃癌发生发展中的调控功能和诊断价值将在人类胃癌诊断和基因靶向治疗方面发挥重要作用。因此，明确HoxD10在胃癌中的应用,具有广泛的科研和临床应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述缺陷，提供一种HoxD10基因作为IGFBP3靶基因的调控者在制备调节癌症细胞中IGFBP3表达水平药物或试剂盒中的用途，具体地，是HoxD10基因促进IGFBP3的表达，尤其是可在RNA和蛋白水平同时促进IGFBP3的表达，所述的癌症细胞主要为胃癌细胞。所述的IGFBP3启动子区域和转录因子HoxD10结合的位点为HBSII、HBS3、HBS4和HBS5。本专利技术还提供了一种IGFBP3作为癌症治疗靶点在制备治疗癌症药物或试剂盒中的用途。本专利技术还提供了一种转录因子HoxD10在制备抑制胃癌细胞增殖或迁移、或促进胃癌细胞凋亡的药物或试剂盒中的用途。本专利技术通过实验发现胃癌细胞中HoxD10的表达水平影响细胞的增值、迁移能力、凋亡等，对胃癌的发生起重要作用，且转录因子HoxD10在胃癌中甲基化的表达调控和启动子甲基化检测可应用于胃癌的诊断，此外，本实验通过软件预测、构建载体，在胃癌细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了IGFBP3是HoxD10的靶基因，并进一步确定了其活性结合位点，本专利技术为利用HoxD10为胃癌提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。附图说明图1：胃癌与癌旁组织、胃肠化组织、慢性浅表性胃炎组织、胃癌细胞株AGS\MKN28\MKN45\NCI-N87甲基化检测情况。T:胃癌组织；A:癌旁正常组织；IM:肠化伴有萎缩胃组织；N:慢性浅表性胃炎组织；M:甲基化；U:非甲基化；图2是5-Aza-dC处理胃癌细胞株AGS\MKN28\MKN45\NCI-N87后，HoxD10表达情况的变化；图3是胃癌细胞系与慢性浅表性胃炎组织中HoxD10的相对表达含量；图4是胃癌与癌旁组织中HoxD10的相对表达含量；图5是过表达HoxD10抑制AGS细胞的增殖；图6是过表达HoxD10抑制MKN28细胞在裸鼠皮下所形成瘤块的生长；图7是过表达HoxD10促进AGS和MKN28细胞的凋亡；图8是过表达HoxD10抑制AGS细胞的迁移；图9是cDNAmicroarray芯片分析MKN28细胞稳定转染HoxD10后相关基因的表达变化；图10中：10.1是过表达HoxD10对IGFBP3表达的影响(A：RT-PCR，B：WesternBlotting)；10.2是过表达HoxD10后对IGFBP3启动子转录活性的影响；10.3是IGFBP3的预测结合位点对HoxD10的募集；10.4是BGC823细胞中HoxD10对预测的IGFBP3结合位点转录活性的调节；10.5是SGC7901细胞中HoxD10对预测的IGFBP3结合位点转录活性的调节。具体实施方式本专利技术的目的通过下述技术方案实现：1.本专利技术首先对不同胃癌细胞株(AGS、MKN28、MKN45和NCI-N87)进行了5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-dC)去甲基化处理，RT-PCR和Westernblot分别检测药物处理前后HoxD10的表达情况；甲基化特异PCR(MSP)检测不同胃癌细胞株启动子甲基化情况；并检测正常胃组织、胃癌前状态和胃癌不同阶段HoxD10启动子甲基化的频度。2.采用FugeneHD转染试剂将pcDNA3.1-HoxD10质粒转染入AGS和MKN28细胞，加入G418筛选，14天后可得到稳定转染HoxD10的入AGS和MKN28细胞。采用MTS和裸鼠皮下移植瘤技术，检测胃癌细胞中HoxD10过表达后癌细胞增殖情况的变化。3.采用AnnexinV/PI双染法，通过流式细胞仪检测胃癌细胞中HoxD10过表达后癌细胞凋亡情况的变化。4.采用Transwell小室迁移试验，检测胃癌细胞中HoxD10过表达后癌细胞迁移情况的变化。5.利用基因表达谱芯片技术筛选HoxD10调控的下游靶基因。对其中的靶基因IGFBP3进行进一步研究。在稳定转染HoxD10的MKN28胃癌细胞中进行qPCR验证；采用RT-PCR，Westernblotting和双荧光素酶报告基因检测系统，检测胃癌细胞BGC823和SGC7901中HoxD10过表达后，IGFBP3的mRNA、蛋白质及启动子转录活性的变化。利用启动子结合位点预测软件预测IGFBP3启动子区域可能和转录因子HoxD10结合的位点，采用染色质免疫共沉淀检测能够募集HoxD10的位点，采用双荧光素酶报告基因检测系统进一步明确HoxD10的活性结合位点。具体过程如下：1、组织样品的准备经浙江大学医学院附属邵逸夫医院伦理委员会批准、患者签署知情同意书后收集患胃癌行胃切除术患者样本共33例。每例患者于手术中收集肿瘤及癌旁非肿瘤组织各一块，立刻液氮冻存。胃镜室收集2例慢性浅表性胃炎组织，液氮冻存。2.甲基化检测胃部组织或胃癌细胞采用天根血液组织细胞基因组提取试剂盒提取基因组DNA，重亚硫酸盐处理后，用HoxD10的甲基化引物及非甲基化引物：甲基化引物(M)F5’-TTATTTATGGGGATTCGGGTTC,R5’-AAAAAAACCGAATCCAAAACAAACG,非甲基化引物(U)F5’-ATTTATTTATGGGGATTTGGGTTT，R5’-AAAAAAACCAAATCCAAAACAAACA分别进行扩增,发现胃癌组织(T)中HoxD10启动子甲基化频度最高(85.7％,24/28)，胃癌前状态(肠上皮化生)组织(IM)亦存在高频度甲基化(60％，18/30)，正常组织(N)无甲基化或低甲基化(0/10)(图1)。3、RNA的提取在消化离心下的细胞或碾碎的组织中加入1ml的Trizol，振荡混匀；加入200μl氯仿，颠倒混匀，静置5分钟后低温离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HoxD10基因作为IGFBP3靶基因的调控者在制备调节癌症细胞中IGFBP3表达水平药物或试剂盒中的用途。

【技术特征摘要】
1.一种HoxD10基因作为IGFBP3靶基因的调控者在制备调节癌症细胞中IGFBP3表达水平药物或试剂盒中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的调节癌症细胞中IGFBP3表达水平为：HoxD10基因促进IGFBP3的表达。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的癌症细胞主要为胃癌细胞。4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，HoxD10基因在RNA和蛋白水平同时促进IGF...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈淑洁，王良静，薛猛，林正铧，姒健敏，
申请(专利权)人：浙江大学，杭州民安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33