本发明专利技术提供了一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的引物、试剂盒和方法。本发明专利技术基于数字PCR技术平台，设计特异性引物对L858R基因位点区域进行特异扩增，设计标记不同荧光的特异性TaqMan MGB探针对突变型、野生型DNA模板进行识别，通过对荧光信号的强度进行分析，判断样本是否存在突变及突变的比例。本发明专利技术与定量PCR技术相比，不依赖于标准品和标准曲线，采用绝对定量的方式直接检测靶序列的拷贝数，具有更高的灵敏度和精确性。本发明专利技术针对非小细胞肺癌患者提供靶向治疗相关基因位点突变信息，为肺癌精准用药指导及疗效监测提供了重要的参考依据。
【技术实现步骤摘要】
一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的引物、试剂盒和方法
本专利技术属于分子生物学领域，特别是核酸检测领域，具体涉及一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的引物、试剂盒和方法。
技术介绍
肺癌是各种肺部恶性肿瘤的统称，是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，位居我国城市人口恶性肿瘤死亡原因之首。肺癌分为小细胞肺癌(smallcelllungcarcinoma,SCLC)和非小细胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma,NSCLC)两类，非小细胞肺癌约占所有肺癌病例的80％以上，包括两大类：1)非鳞癌(包括腺癌、大细胞癌及其他亚型)；2)鳞状细胞(表皮样)癌。晚期肺癌的治疗包括化疗、放疗和靶向治疗，传统的化疗放疗存在靶向不明确，选择性不强等特点，导致在达到治疗效果的同时带来较大的副作用。肺癌靶向治疗是指抗肿瘤药物与肺癌细胞特异性靶点发生作用而杀死肿瘤细胞,对正常组织影响较小。目前靶向治疗是肺癌精准治疗的主要方法之一。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是一种跨膜酪氨酸激酶受体，EGFR基因位于人类7号染色体短臂7p12～14区域，由28个外显子组成，相对分子质量为170KD。受体激酶活性区域激活与肿瘤细胞增殖、转移等信号通路有关。EGFR突变主要发生在胞内酪氨酸激酶(TK)区域的前四个外显子上(18～21)，目前发现的TK区域突变有30多种。亚裔人群肺腺癌患者EGFR基因敏感突变率要高于高加索人群。临床上使用的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitors,EGFR-TKIs)吉非替尼、厄洛替尼、埃可替尼、阿法替尼，对于存在EGFR基因敏感突变的晚期非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)患者，与传统化疗相比，能显著延长患者的无进展生存(progressionfreesurvival,PFS)时间，同时由于靶向治疗较小的副作用能提高患者的生存质量及治疗依从性。人EGFR基因21外显子上的L858R为常见的EGFR-TKIs敏感突变之一，针对EGFR基因L858R突变的定量检测可预测EGFR-TKIs在肺癌患者中的有效性，L858R的突变丰度与EGFR-TKI疗效与预后有关，因此EGFR基因L858R突变检测已成为NSCLC患者用药指导和疗效监测必须参考的重要指标。目前基因突变的检测技术主要有一代测序、二代测序、ARMS-PCR检测、数字PCR检测等。一代测序、ARMS-PCR检测为定性检测，灵敏度较差；高通量测序为定量检测，但操作流程复杂，对人员及仪器要求较高，检测成本较贵；数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准品和标准曲线，直接检测靶序列的拷贝数，这种检测方式具有更高的灵敏度、精确性和经济性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的引物，本专利技术提供了一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的试剂盒，本专利技术还提供了一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的方法。为实现上述目的，所采取的技术方案：一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的引物，包括正向引物和反向引物；所述正向引物包括如SEQIDNO:1～SEQIDNO:3所示的核苷酸序列中的至少一种；所示反向引物包括如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5所示的核苷酸序列中的至少一种。所述正向引物包括以下核苷酸序列中的至少一种：SEQIDNO:1F1:GCAGCATGTCAAGATCACAGATT；SEQIDNO:2F2:ACACCGCAGCATGTCAAGATC；SEQIDNO:3F3:GAAAACACCGCAGCATGTCA。所述反向引物含有以下核苷酸序列中的至少一种：SEQIDNO:4R1：CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT；SEQIDNO:5R2：CATGGTATTCTTTCTCTTCCGCA。优选地，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，所示反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。本专利技术提供了一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的试剂盒，包括上述所述的引物，还包括与人EGFR基因L858R突变型DNA模板结合的TaqManMGB突变型探针，以及与人EGFR基因L858R野生型DNA模板结合的TaqManMGB野生型探针，所述TaqManMGB突变型探针和TaqManMGB野生型探针的5’端均带有荧光报告基团，所述TaqManMGB突变型探针和TaqManMGB野生型探针的3’端均带有小沟结合物MGB与非荧光淬灭基团，所述TaqManMGB突变型探针5’端带有的荧光报告基团和TaqManMGB野生型探针5’端带有的荧光报告基团不同。本专利技术针对人EGFR基因L858R位点突变型、野生型DNA序列设计标记不同荧光的TaqManMGB探针。优选地，所述TaqManMGB突变型探针的核苷酸部分含有如SEQIDNO:6、SEQIDNO:7所示的核苷酸序列中的一种，所述TaqManMGB野生型探针的核苷酸部分含有如SEQIDNO:8、SEQIDNO:9所示的核苷酸序列中的一种。优选地，所述TaqManMGB突变型探针为：5’-FAM-CAGTTTGGCCCGCCCA-MGB-NFQ-3’(SEQIDNO:6)，所述TaqManMGB野生型探针为：5’-VIC-CAGTTTGGCCAGCCCA-MGB-NFQ-3’(SEQIDNO:8)；或者所述TaqManMGB突变型探针为：5’-FAM-TTGGCCCGCCCAAAC-MGB-NFQ-3’(SEQIDNO:7)，所述TaqManMGB野生型探针为：5’-VIC-TTGGCCAGCCCAAAC-MGB-NFQ-3’(SEQIDNO:9)。更优选地，所述TaqManMGB突变型探针为：5’-FAM-CAGTTTGGCCCGCCCA-MGB-NFQ-3’(SEQIDNO:6)，所述TaqManMGB野生型探针为：5’-VIC-CAGTTTGGCCAGCCCA-MGB-NFQ-3’(SEQIDNO:8)。优选地，所述试剂盒还包括PCR预混液，所述预混液包括dNTPs、Taq酶和PCR缓冲液。本专利技术提供了一种基于数字PCR检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的方法，所述方法是采用上述所述的引物或者上述所述的试剂盒来检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的。优选地，上述所述方法具体包括以下步骤：(1)从待检样本中提取基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，加入上述所述的试剂盒中的正向引物、反向引物、TaqManMGB突变型探针和TaqManMGB野生型探针来配制数字PCR扩增反应体系；(3)将数字PCR反应体系分割成独立反应体系后进行PCR扩增；(4)使用检测器对独立反应体系的荧光信号进行检测，根据突变型EGFR核酸分子模板的微滴信号检测仪给出的荧光信号与野生型EGFR核酸分本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物；所述正向引物包括如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列中的至少一种；所示反向引物包括如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列中的至少一种。
【技术特征摘要】
1.一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物；所述正向引物包括如SEQIDNO:1～SEQIDNO:3所示的核苷酸序列中的至少一种；所示反向引物包括如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5所示的核苷酸序列中的至少一种。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，所示反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。3.一种检测人EGFR基因21号外显子L858R位点突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-2任一所述的引物，还包括与人EGFR基因L858R突变型DNA模板结合的TaqManMGB突变型探针，以及与人EGFR基因L858R野生型DNA模板结合的TaqManMGB野生型探针，所述TaqManMGB突变型探针和TaqManMGB野生型探针的5’端均带有荧光报告基团，所述TaqManMGB突变型探针和TaqManMGB野生型探针的3’端均带有小沟结合物MGB与非荧光淬灭基团，所述TaqManMGB突变型探针5’端带有的荧光报告基团和TaqManMGB野生型探针5’端带有的荧光报告基团不同。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述TaqManMGB突变型探针的核苷酸部分含有如SEQIDNO:6、SEQIDNO:7所示的核苷酸序列中的一种，所述TaqManMGB野生型探针的核苷酸部分含有如SEQIDNO:8、SEQIDNO:9所示的核苷酸序列中的一种。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述TaqManMGB突变型探针为：5’-FAM-CAGTTTGGCCCGCCCA-MGB-NFQ-3’，所述TaqManMGB野生型探针为：5’-VIC-CAGTTTGGCCAGCCCA-MGB-NFQ-3’；或者所述TaqManMGB突变型探针为：5’-FAM-TTGGCCCGCCCAAAC-MGB...
【专利技术属性】
技术研发人员：许少飞，赖炳权，罗景燕，苏普霞，李伟琴，
申请(专利权)人：广州永诺生物科技有限公司，广东顺德永诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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