本发明专利技术公开了一种鼠抗人IDH1 R132H突变蛋白的单克隆抗体，特异性高、表现稳定且效价高，可用于检测恶性肿瘤中IDH1 R132H突变蛋白，具有一定的医学基础研究价值。本发明专利技术还涉及上述单克隆抗体在制备用于检测IDH1 R132H突变蛋白的免疫组化检测工具中的应用。本发明专利技术建立基于IDH1 R132H单克隆抗体的免疫组织化学技术，用于恶性肿瘤，主要包括神经胶质瘤和急性髓系白血病的辅助诊断、治疗方案选择和预后。鉴于免疫组化方法操作简单，收费较低，绝大部分病理实验室均可以开展，免疫组化方法可作为临床工作中IDH1 R132H基因突变的首选检测方法。
【技术实现步骤摘要】
鼠抗人IDH1R132H突变蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途
本专利技术涉及免疫学领域，特别涉及一种鼠抗人IDH1R132H突变蛋白的单克隆抗体，以及该抗体的免疫组化用途。
技术介绍
异柠檬酸脱氢酶1（Isocitratedehydrogenase1，IDH1）全长1245bp，编码414个氨基酸，属于NADP依赖型β脱羧脱氢酶家族成员，是三羧酸循环中的关键限速酶，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸（α-KG）和二氧化碳（CO2），为细胞新陈代谢提供能量和生物合成前体物质。IDH1突变是继发性胶质瘤诊断和预后的标志物，其中R132H最常见，占90%以上。IDH1-R132基因突变主要发生在世界卫生组织（WHO）Ⅱ-Ⅳ级的弥漫性星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突-星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、间变型少突胶质细胞瘤、间变型少突-星形细胞瘤和胶质母细胞瘤。R132是IDH1活性中心的必需氨基酸之一，由IDH1突变基因编码翻译而成的IDH1蛋白酶不仅数量减少，而且还破坏了该酶的亲和力，并与野生型IDH1竞争底物，形成二聚体，从而抑制野生型IDH1活性，使其催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-KG和NADPH的量显著减少，导致细胞内还原产物降低，削弱了细胞内修复氧化应激所致DNA损伤的能力，同时还可导致细胞低氧诱导因子-1α（HIF-1α）含量增加，从而激活HIF信号通路，最终促进肿瘤生长。神经胶质瘤呈浸润性生长，与正常脑组织界限不清，仅靠手术难以治愈，并且由于血脑屏障等因素的影响，化疗药物和一般抗肿瘤的中药治疗效果也不尽理想，脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。研究报道IDH1R132H突变型胶质瘤患者对化疗更敏感，生存期更长。因此，如何发现有效的胶质瘤诊治分子靶点就显得尤为重要，相关分子靶点的发现将对胶质瘤的预后预测以及对化疗药物的反应性等具有重要的科学意义和临床应用价值。临床研究发现mIDH1R132H分子标志物具有较高的特异性和敏感性，可用于反应性胶质增生与低级别胶质瘤的鉴别诊断。在急性髓系白血病中，IDH1R132H也是一种经常发生的突变类型。目前，国内外研发的IDH1R132H抗体稀少，特异性和亲和力方面均有待提高，因此亟待研发新的性能优异的抗IDH1R132H单克隆抗体，填补国内本行业的空白，降低治疗费用，减轻病人负担。本专利技术研制出一种特异性高、表现稳定且效价高的抗IDH1R132H突变蛋白的特异性单克隆抗体，可用于恶性肿瘤中IDH1R132H突变蛋白的表达水平研究，疾病发生、进展、预后相关的病理生理研究，具有一定的医学基础研究价值。本专利技术采用免疫组化（IHC）方法，建立基于所述IDH1R132H单克隆抗体的免疫组织化学技术，用于恶性肿瘤，主要包括神经胶质瘤和急性髓系白血病的辅助诊断、治疗方案选择和预后。鉴于免疫组化方法操作简单，收费较低，绝大部分病理实验室均可以开展，免疫组化方法可作为临床工作中IDH1R132H基因突变的首选检测方法。
技术实现思路
基于以上所述的现有技术现状，本专利技术的目的为提供一种特异性好、表现稳定且效价高的抗IDH1R132H突变蛋白的单克隆抗体，并建立基于所述IDH1R132H单克隆抗体的免疫组织化学技术。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术所述IDH1R132H单克隆抗体的制备方法如下：（1）免疫源的制备：根据IDH1基因（BC012846）序列信息，订购合成携带R132H基因突变，且N末端带BSA序列（提高多肽的免疫原性）的人类IDH-R132H多肽（加拿大应用生物材料有限公司，AppliedBiologicalMaterialsInc.），用于免疫实验动物和ELISA筛选阳性克隆。（2）单抗的筛选与制备：采用上述合成的IDH1R132H多肽免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，使用IDH1R132H多肽预铺的96孔板采用ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗IDH1R132H特异性抗体的杂交瘤细胞株；制备小鼠腹水，通过proteinA柱层析纯化IDH1R132H单抗。通过免疫组化实验（结果见图1和图2）验证该单抗的灵敏度和特异性。同时，本专利技术提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测IDH1R132H蛋白的免疫组化工具中的应用。所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备用于检测恶性肿瘤的免疫组化用途。由于IDH1R132H是继发性胶质瘤诊断和预后的标志物，且在急性髓系白血病中，IDH1R132H也是一种经常发生的突变类型。因此检测IDH1R132H在肿瘤细胞表面的表达，对于分析机体恶性肿瘤，主要包括神经胶质瘤和急性髓系白血病的诊断、治疗方案以及对化疗药物的反应性具有重要的指导作用。以使用Leica的免疫组化自动染色机BondMax为例，应用该IDH1R132H单克隆抗体进行免疫组化染色的条件为：（1）使用机器自带的IHCprotocolF，将过氧化物酶封闭步骤由使用一抗前移至DAB显色前；（2）抗体使用终浓度为1.0μg/ml，室温孵育30min；（3）抗原修复使用pH9.0的抗原修复液（ER2），100℃加热孵育30min。使用其他IHC自动染色机或进行手工染色时，请参照上述条件进行。本专利技术所述的特异性单抗，可与IDH1R132H突变蛋白特异结合，同时建立了基于该单克隆抗体的免疫组织化学技术，可用于恶性肿瘤，主要包括神经胶质瘤和急性髓系白血病的辅助诊断、治疗方案选择和预后。鉴于免疫组化方法操作简单，收费较低，绝大部分病理实验室均可以开展，免疫组化方法可作为临床工作中IDH1R132H基因突变的首选检测方法。附图说明图1为以本专利技术单克隆抗体为一抗，免疫组化法检测染色图。其中A为IDH1R132H突变基因高表达（阳性）的星形胶质细胞系染色图，B为无IDH1R132H突变基因高表达（阴性）的星形胶质细胞系染色图。图2为以本专利技术单克隆抗体为一抗，免疫组化法检测星形胶质细胞瘤中IDH1R132H突变蛋白的表达染色图。具体实施方式本专利技术公开一种特异性好、表现稳定且效价高的抗IDH1R132H突变蛋白的单克隆抗体，以及检测肿瘤细胞IDH1R132H突变蛋白的免疫组化用途。本领域技术人员可参考本文内容进行适当改进以实现和应用本专利技术的技术，但是类似的替换和改动应视为包括在本专利技术。为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1抗IDH1R132H单克隆抗体的制备一、免疫源的制备：根据IDH1基因（BC012846）序列信息，订购合成携带R132H基因突变，且N末端带BSA序列（提高多肽的免疫原性）的人类IDH-R132H多肽，用于免疫实验动物和ELISA筛选阳性克隆。二、单抗的筛选与制备1、动物免疫：上述合成的IDH1R132H多肽以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。2、细胞融合：本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种鼠抗人单克隆抗体，其特征在于能够特异性结合人IDH1 R132H突变蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种鼠抗人单克隆抗体，其特征在于能够特异性结合人IDH1R132H突变蛋白。2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于特异性检测IDH1R132H突变蛋白的免疫组化检测工具中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫组化检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该免疫组化检测工具可...
【专利技术属性】
技术研发人员：高源远，李军，李沛祥，李雪，方洁羽，朱禹宣，
申请(专利权)人：南京基诺米医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。