本发明专利技术公开了一种翘嘴鳜IFN‑α3基因、重组蛋白、制备方法及应用。本发明专利技术通过采用cDNA末端快速扩增RACE技术克隆翘嘴鳜IFN‑α3全长cDNA序列，如SEQ ID NO：1所示；利用带有酶切位点的引物克隆出该cDNA序列的ORF序列；将ORF序列克隆入pMD19T载体后，再用EcoR I和Xho I进行双酶切得到目的片段；用EcoR I和Xho I对pET32a(+)载体进行双酶切，将该双酶切载体与所述目的片段连接，得到pET32a(+)‑IFN‑α3重组表达载体，转入DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆并提取保存质粒；将质粒转入表达菌BL21，经IPTG诱导表达获得IFN‑α3重组蛋白，如SEQ ID NO：2所示。该IFN‑α3重组蛋白可用于浸泡免疫预防翘嘴鳜病毒病方面，能够有效激活翘嘴翘嘴鳜进入抗病毒状态，降低死亡率。
IFN- alpha 3 gene, recombinant protein, preparation and application of mandarin fish
The invention discloses a IFN 3 gene, a recombinant protein, a preparation method and an application thereof. In the present invention, the full-length cDNA sequence of IFN_alpha3 of Mandarin Mandarin Mandarin Mandarin (Siniperca chuatsi) was cloned by rapid amplification of RACE at the end of the cDNA, as shown in SEQ ID NO:1; the ORF sequence of the cDNA sequence was cloned by using primers with digestion sites; the ORF sequence was cloned into pMD19T vector, and the target fragment was obtained by double digestion with EcoR I and Xho I. The recombinant expression vector pET32a (+) SEQ ID NO:2 shows. The recombinant IFN_alpha 3 protein can be used for immersion immunization to prevent viral disease of Mandarin Mandarin Mandarin, and can effectively activate Mandarin Mandarin Mandarin Mandarin to enter an antiviral state and reduce mortality.
【技术实现步骤摘要】
翘嘴鳜IFN-α3基因、重组蛋白、制备方法及应用
本专利技术属于水产养殖、生物技术和医药生物工程领域，尤其涉及一种翘嘴鳜IFN-α3基因、IFN-α3重组蛋白、IFN-α3重组蛋白的制备方法以及IFN-α3重组蛋白在浸泡免疫预防翘嘴鳜病毒病方面的应用。
技术介绍
在鱼类养殖中，病毒性疾病往往是造成损失大面积减产的重要因素，其发病迅速且无有效的治疗药物和手段，盲目用药还会造成药物残留和环境污染，采用疫苗手段可取得安全高效的防治效果，是今后鱼类病毒性疾病防治的发展方向。干扰素(Interferons，IFNs)是一种具有多功能活性的，分泌型的蛋白质，当机体和细胞受到病毒或其它诱导剂刺激后，能够诱导脊椎动物淋巴细胞和单核细胞产生的一系列体液免疫和细胞免疫因子，诱导产生多种抗病毒蛋白，包括：Mx、PKR、Viperin、IRF-1与IRF-2a、IRF-2b、IRF-7等抗病毒蛋白，进入抗病毒状态，从而很好地抵御病毒病的发生，并且IFN-α抗病毒作用要高于IFN-γ和IFN-β。但目前鱼类的疫苗均通过灭活染病病原来制备，由于病毒来源有限，无法制备大批量疫苗，而且鱼类是非特异性免疫，其免疫效果受到一定影响；另一方面，常用的注射免疫方式操作麻烦，使得鱼类疫苗的应用和推广受到了很大的限制。因此，开发成本低廉、免疫方式简便的疫苗对鱼类养殖业的健康发展尤为重要。翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)是中国重要的名优淡水养殖品种，随着养殖密度的提高，养殖病害愈发严重，导致翘嘴鳜暴发性死亡最严重的是由传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)也称虹彩病毒(MRV)引起的传染性病毒感染疾病，不仅带来巨大经济损失，还制约翘嘴鳜养殖业的发展。由于翘嘴鳜是终身以活鱼为食，口服或注射的免疫方式很难在翘嘴鳜养殖中使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种全新克隆到的翘嘴鳜IFN-α3基因。本专利技术的再一目的在于提供上述翘嘴鳜IFN-α3基因表达到的IFN-α3重组蛋白。本专利技术的再一目的在于提供上述IFN-α3重组蛋白的的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供上述IFN-α3重组蛋白在浸泡免疫预防翘嘴鳜病毒病方面的应用，旨在解决口服或注射的免疫方式很难在翘嘴鳜养殖中得到应用的问题。本专利技术是这样实现的，一种翘嘴鳜IFN-α3基因，该基因的cDNA序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术的进一步公开了一种翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白，该蛋白序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术进一步公开了翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)采用cDNA末端快速扩增RACE技术克隆翘嘴鳜IFN-α3全长cDNA序列；(2)利用带有酶切位点的引物克隆出该cDNA序列的ORF序列；(3)将所述ORF序列克隆入pMD19T载体后，再用EcoRI和XhoI进行双酶切得到目的片段；(4)用EcoRI和XhoI对pET32a(+)载体进行双酶切，将该双酶切载体与所述目的片段连接，得到pET32a(+)-IFN-α3重组表达载体，转入DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆并提取保存质粒；(5)将所述质粒转入表达菌BL21，经IPTG诱导表达获得IFN-α3蛋白。优选地，在步骤(1)中，所述翘嘴鳜IFN-α3全长cDNA序列的克隆包括翘嘴鳜IFN-α35’端序列的扩增以及3’端序列的扩增；其中，在5’端序列的扩增中：IFN-α3第一链cDNA的克隆引物为：GSP1：5’-ATGAGCTGGACGAGAG-3’；PCR第一轮扩增引物为：GSP2：5’-AGCTGTTGCTCACATGACCG-3’；PCR第二轮扩增引物为：GSP3：5’-GCCAATCACAGCAGAGCG-3’；AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’；在3’端序列的扩增中：IFN-α3第一链cDNA的克隆引物为：3’CDSPrimerA：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGACTAC-3’；PCR第一轮扩增引物为：GSP4：5’-TGGAGAAAAGCACTCTGTACCGCAC-3’；UPM：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’；PCR第二轮扩增引物为：GSP5：5’-TGATCAGGAAGGAAACTGAAGTGCA-3’；UPM：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’。优选地，在步骤(2)中，所述带有酶切位点的引物为：IFN-α3-EcoRI-F：5’-TCCGAATTCTGTGATTGGCTCA-3’；IFN-α3-XhoI-R：5’-GCTCGAGTCAGTGTTGGTGA-3’。本专利技术进一步公开了上述翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白在浸泡免疫预防翘嘴鳜病毒病方面的应用。更具体的，该应用的方法包括以下步骤：取1～4厘米长的翘嘴鳜浸泡在免疫浸泡液中进行IFN-α3蛋白疫苗浸泡免疫，所述免疫浸泡液为含有所述IFN-α3蛋白的水体；将浸泡免疫后的翘嘴鳜置于25℃环境下，投喂赤眼鳟鱼进行恒温养殖。优选地，水体中IFN-α3蛋白浓度大于100mg/L；翘嘴鳜在水体中的浸泡时间大于60min。本专利技术克服现有技术的不足，提供一种翘嘴鳜IFN-α3基因、IFN-α3重组蛋白、IFN-α3重组蛋白的制备方法以及IFN-α3重组蛋白在浸泡免疫预防翘嘴鳜病毒病方面的应用。本专利技术通过从翘嘴鳜中克隆IFN-α3全长cDNA，采用pET32a(+)原核表达系统表达IFN-α3重组蛋白，以割胶纯化的翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白为免疫原，制成免疫浸泡液，将翘嘴鳜浸泡在其中，进行浸泡免疫；免疫后的翘嘴鳜置于25℃环境下、投喂赤眼鳟鱼进行恒温养殖。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过克隆IFN-α3基因，表达和纯化IFN-α3重组蛋白，并采用浸泡免疫的方式对翘嘴鳜苗进行免疫，经试验证明，采用本专利技术所述方法免疫后，能够有效激活翘嘴翘嘴鳜进入抗病毒状态，有效提高翘嘴翘嘴鳜胸腺、头肾、脾脏、肝脏、体肾、血中IFN-α3转录水平的显著上调，抗病毒相关基因(Mx、PKR、Viperin、IRF-1与IRF-2a、IRF-2b、IRF-7等)的表达量也相应提高，从而提高抗病毒能力，能够显著降低ISKNV病毒感染翘嘴翘嘴鳜的死亡率。附图说明图1是IFN-α3原核表达载体构建时所得产物的电泳结果图；其中，图A为IFN-α3ORF段PCR产物；图B为pMD19T-IFN-α3和pET32a(+)双酶切产物；图C为将pET32a(+)-IFN-α3转入DH5α后的阳性克隆；各图中，泳道1、3、6均为MarkerDL5000；泳道2为IFN-α3ORF段PCR产物；泳道4为pMD19T-IFN-α3双酶切产物；泳道5为pET32a(+)双酶切产物；泳道7为将pET32a(+)-IFN-α3转入DH5α后的阳性克隆；图2是E.coliBL21(DE3)表达的rgcIFN-α3和Trx蛋白SDS-PAGE电泳结果图；其中，泳道M为marker(kDa)；泳道1为pET-32a(+)-IFN-α3/BL21诱导后总细菌裂解物；泳道2为pET-32a(+)-IFN-α3/BL21未诱导总细菌裂解物；泳道3为pET32a(+)/BL21诱导后总细菌裂解物；泳道4为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种翘嘴鳜IFN‑α3基因，其特征在于，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种翘嘴鳜IFN-α3基因，其特征在于，该基因的cDNA序列如SEQIDNO：1所示。2.一种翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白，其特征在于，该蛋白序列如SEQIDNO：2所示。3.权利要求2所述的翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)采用cDNA末端快速扩增RACE技术克隆翘嘴鳜IFN-α3全长cDNA序列；(2)利用带有酶切位点的引物克隆出该cDNA序列的ORF序列；(3)将所述ORF序列克隆入pMD19T载体后，再用EcoRI和XhoI进行双酶切得到目的片段；(4)用EcoRI和XhoI对pET32a(+)载体进行双酶切，将该双酶切载体与所述目的片段连接，得到pET32a(+)-IFN-α3重组表达载体，转入DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆并提取保存质粒；(5)将所述质粒转入表达菌BL21，经IPTG诱导表达获得IFN-α3蛋白。4.如权利要求3所述的翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述翘嘴鳜IFN-α3全长cDNA序列的克隆包括翘嘴鳜IFN-α35’端序列的扩增以及3’端序列的扩增；其中，在5’端序列的扩增中：IFN-α3第一链cDNA的克隆引物为：GSP1：5’-ATGAGCTGGACGAGAG-3’；PCR第一轮扩增引物为：GSP2：5’-AGCTGTTGCTCACATGACCG-3’；PCR第二轮扩增引物为：GSP3：5’-GCCAATCACAGCAGAGCG-3’；AUAP：...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄鹤忠，肖攀，路瑶，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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