一种干扰素α-2b突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种干扰素α‑2b突变体及其制备方法和应用，天然的干扰素α‑2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为脂肪族类氨基酸，和/或，从N端计第110位的亮氨酸突变为杂环氨基酸，所述的脂肪族类氨基酸选自蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的一种，所述的杂环氨基酸选自脯氨酸、组氨酸和色氨酸中的一种。本发明专利技术提供的干扰素α‑2b突变体的比活性高、稳定性好、体内半衰期大大延长，可以提高患者使用干扰素药物的依从性，血药浓度波动小，也进一步提高了疗效。

A kind of interferon alpha 2b mutant and its preparation method and Application

The invention discloses a interferon alpha 2b mutant and its preparation method and application of lysine amino acid sequence of interferon alpha natural 2b in from the N eighteenth mutation for aliphatic amino acid, and / or from the end of 110th, N leucine mutation is a heterocyclic amino acid. The aliphatic amino acid selected from methionine, alanine, glycine and valine in, one of the heterocyclic amino acid selected from the group consisting of proline, histidine and tryptophan. The invention provides interferon alpha 2b mutants than high activity, good stability and in vivo half-life is prolonged, can improve patient compliance with interferon drugs, the fluctuation of blood concentration, but also further enhance the curative effect.

【技术实现步骤摘要】
一种干扰素α-2b突变体及其制备方法和应用
本专利技术属于干扰素领域，具体地说，涉及一种干扰素α-2b突变体及其制备方法。
技术介绍
干扰素(Interferon，IFN)是人和动物细胞受到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等多种因素诱导后，由受体细胞分泌的一类细胞因子，具有广谱抗病毒及免疫调节等作用；1957年由Isaacs和JeanLindenmann首先发现。目前，根据干扰素的产生细胞、受体和活性等综合因素一般将干扰素分为Ⅰ型、Ⅱ型和III型三类，Ⅰ型干扰素主要包括IFN-α和IFN-β，Ⅱ型只包括IFN-γ，III型干扰素包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3。自发现干扰素以来，由于其广谱抗病毒、抗肿瘤以及强大的免疫调节作用而成为免疫学、病毒学、细胞生物学、分子生物学、临床医学、肿瘤学等相关领域的研究热点。同时，干扰素作为生物体内基因自身稳定的一个系统，奠定了在生物学研究中的地位。目前已知除抗病毒活性外，IFN还具有免疫调节、抑制细胞增殖、抗肿瘤生长、与多种淋巴因子协同作用等多种重要的生物功能。干扰素α2b(Interferonα2b，IFNα2b)作为一种具有广泛生物学活性的细胞因子，在抗病毒、抗细菌感染和抗肿瘤等治疗中被广泛应用。目前，在临床上IFNα2b已被广泛应用于HPV感染，慢性髓系白血病和肾癌等的治疗，并取得了显著的效果。但是天然的干扰素α2b体内半衰期比较短，一般t1/2只有1.5-2.0个小时左右，因此临床应用需要反复给药，患者依从性比较差；而且因为半衰期短而导致血药浓度波动大，导致疗效不佳。延长干扰素半衰期的方法主要有PEG修饰、白蛋白融合等技术。目前已开发上市的聚乙二醇干扰素α-2b制剂，半衰期可达40～65h。但是，PEG的修饰也存在扩散速度受限和生物活性低等问题。同样，白蛋白融合干扰素蛋白分子更大，也存在药物自血液向目标组织的输送速度受到限制的问题。因此，如何提高干扰素α-2b的稳定性，延长其半衰期是本领域急需解决、有重要意义的问题。有鉴于此特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种干扰素α-2b突变体及其制备方法和应用，本专利技术提供的干扰素α-2b突变体的比活性高、稳定性好、体内半衰期大大延长，可以提高患者使用干扰素药物的依从性，血药浓度波动小，也进一步提高了疗效。为解决上述技术问题，本专利技术采用技术方案的基本构思是：本专利技术的第一目的是提供一种干扰素α-2b突变体，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为其它的脂肪族类氨基酸，和/或，从N端计第110位的亮氨酸突变为杂环氨基酸。天然干扰素α-2b体内半衰期比较短，临床应用需要反复给药，患者依从性比较差，而采用PEG修饰、白蛋白融合等技术延长其半衰期的方式又存在药物自血液向目标组织的输送速度受到限制的问题、生物活性较低等问题。本专利技术的IFNα-2b突变体氨基酸序列的设计，是根据IFNα2b已知空间结构、受体结合位点及与受体结合原理，通过计算机模拟突变分子的空间结构及进化差异，保证空间结构变化不明显和进化差异较小的条件下，选择了第18位赖氨酸Lys和第110位亮氨酸Leu分别或同时替换为其它的氨基酸，来提高干扰素IFNα-2b的稳定性。经过多次尝试和大量的试验，申请人惊喜的发现IFNα2b氨基酸序列中从N端计的第18位赖氨酸突变为除了赖氨酸以外的一种或者几种脂肪族氨基酸，同时或者分别将110位的亮氨酸Leu突变为杂环氨基酸得到的IFNα2b突变体的安全性高，同时生物活性大大提高，体内的半衰期也大大延长，在临床治疗方面可以使血药浓度较为稳定，提高患者的依从性，提高治疗效果。另外，需要说明的是，本专利技术的氨基酸序列不包括起始密码子编码的氨基酸。进一步的方案，所述的脂肪族类氨基酸选自蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的一种，其氨基酸序列分别如SEQIDNo.2-SEQIDNo.5所示。天然的干扰素α-2b蛋白分子不稳定，18位的赖氨酸为碱性氨基酸，较容易分解，替换为其它非碱性的脂肪族氨基酸有利于提高蛋白质的稳定性。进一步的方案，所述的杂环氨基酸选自脯氨酸、组氨酸和色氨酸中的一种，其氨基酸序列分别如SEQIDNo.6-SEQIDNo.8所示。本专利技术选择替换的杂环氨基酸较为稳定，也均为疏水性氨基酸，有利于提高其稳定性。进一步的方案，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为蛋氨酸，干扰素α-2b突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，核苷酸序列如SEQIDNo.10所示。进一步的方案，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第110位的亮氨酸突变为脯氨酸，干扰素α-2b突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示，核苷酸序列如SEQIDNo.11所示。进一步的方案，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为蛋氨酸，且从N端计第110位的亮氨酸突变为脯氨酸，干扰素α-2b突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.9所示，核苷酸序列如SEQIDNo.12所示。为实现专利技术目的本专利技术提供了3种较为优选的突变方案，天然氨基酸序列中的第18位和110位的氨基酸分别各自突变，或者同时替换：本专利技术提供的优选的IFNα2b突变体，一是将天然IFNα2b氨基酸序列(天然氨基酸序列如SeqNo.1所示)中，从N端计第18位赖氨酸Lys替换为蛋氨酸Met(18Lys→18Met，记为IFNα2bMet18)，氨基酸序列如SeqNo.2；其二是将天然IFNα2b氨基酸序列SeqNo.1中，从N端计第110位亮氨酸Leu替换为脯氨酸Pro(110Leu→110Pro,记为IFNα2bPro110)，如SeqNo.6；其三是将天然IFNα2b氨基酸序列SeqNo.1中，从N端计第18位赖氨酸Lys和第110位亮氨酸Leu分别替换为蛋氨酸Met和脯氨酸Pro(18Lys→18Met，110Leu→110Pro,记为IFNα2bMet18/Pro110)，如SeqNo.9。本专利技术的第二目的是提供一种表达载体，所述表达载体包括如上所述任意一一种干扰素α-2b突变体的核苷酸序列。较为优选的，所述的表达载体含有SEQIDNo.10-SEQIDNo.12的核苷酸序列。本专利技术的第三目的是提供一种如上所述的干扰素α-2b突变体的制备方法，包括以下步骤：(1)构建干扰素α-2b突变体的表达载体；(2)构建含有步骤(1)的表达载体的基因工程菌，并进行培养；(3)提取、纯化干扰素α-2b突变体蛋白。下面提供较为具体的方案：为得到IFNα2b突变体蛋白，首先需要选择表达系统，然后进一步进行基因工程载体、基因工程菌或细胞的构建，工程菌或细胞的发酵培养，发酵产物的提取与纯化等步骤。目前，常用的重组表达系统有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统等。根据大肠杆菌表达系统具有表达量高、操作简便、成本低和遗传背景清楚等优点，本专利技术选择大肠杆菌作为IFNα2b突变的表达系统，优选E.coliBL21(DE3)菌株作为宿主菌。大肠杆菌表达系统，有其专门的表达载体，这类表达载体的特点表现在具有较强的启动子，如T7启动子、PL启动子、tac启动子和tap启动子等；人们公认且本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干扰素α‑2b突变体，其特征在于，干扰素α‑2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为其它的脂肪族类氨基酸，和/或，从N端计第110位的亮氨酸突变为杂环氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种干扰素α-2b突变体，其特征在于，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为其它的脂肪族类氨基酸，和/或，从N端计第110位的亮氨酸突变为杂环氨基酸。2.根据权利要求1所述的一种干扰素α-2b突变体，其特征在于，所述的脂肪族类氨基酸选自蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的一种，其氨基酸序列分别如SEQIDNo.2-SEQIDNo.5所示。3.根据权利要求1所述的一种干扰素α-2b突变体，其特征在于，所述的杂环氨基酸选自脯氨酸、组氨酸和色氨酸中的一种，其氨基酸序列分别如SEQIDNo.6-SEQIDNo.8所示。4.根据权利要求1-3任一所述的一种干扰素α-2b突变体，其特征在于，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第18位的赖氨酸突变为蛋氨酸，干扰素α-2b突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，核苷酸序列如SEQIDNo.10所示。5.根据权利要求1-3任一所述的一种干扰素α-2b突变体，其特征在于，干扰素α-2b的氨基酸序列中从N端计第110位的亮氨酸突变为脯氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘惠，李冠英，张德宝，李海红，
申请(专利权)人：上海华新生物高技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31